miR-32與PTEN在宮頸癌中表達關系

（南華大學附屬郴州市第一人民醫院 423000）

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤之一，晚期宮頸癌患者，由于容易出現的復發、轉移和耐藥，目前療效并不理想[1]。PTEN是一種腫瘤抑制基因，在細胞生長、凋亡、遷移、浸潤等方面有重要作用[2]。前期工作中，發現，miR-32與PTEN結合最穩定，特異性最好。本項目擬研究miR-32和PTEN在宮頸癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

鼠抗人單克隆PTEN、β-actin抗體，脂質體，美國Santa Cruz公司產品。Transwell試劑盒、Matrigel基質膠，美國B&D公司產品。

1.2 miR-32 mimics、NC 及 inhibitors

試劑均由廣州博銳生物科技有限公司合成。

1.3 qRT-PCR

在實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應。qRT-PCR反應體系如下：10μM正向引物1μl;10μM反向引物 1μL;DNA模板 2μL;ddH2O 8.5μL;2×SYBR Primix Ex TaqTMⅡ12.5μL;總反應體系25μL。按以下過程進行：95℃，5 min；35 個 PCR 循環（95℃，10sec；59℃，15sec；72℃，20sec；82℃，5sec）。

1.4 Western blot

:步驟如下：分別收集細胞約108個，抽提細胞的總蛋白；蛋白樣品加熱變性；SDS-PAGE電泳；轉膜：電壓設置為100V，時間約1h；麗春紅溶液中染色3-5min；封閉1-2h；加入適量的封閉液和一抗(一抗濃度為1:1500)；再加封閉液和生物素進行標記的二抗(二抗濃度為1:1000)，常溫下孵育1-2h；壓X光片，定影顯影，洗片，圖像掃描。

1.5 重組細胞系的建立

首先采用脂質體轉染試劑盒(Lipofectamine 2000)將miR-32 mimics、NC及inhibitors序列分別通過脂質體方法轉染宮頸癌Hela細胞系，獲得三個重組細胞株：Hela-miR-32 mimics、Hela-miR-NC、Hela-miR-32-inhibitors。

1.6 統計學分析：采用SPSS18.0進行統計學分析，實驗結果以均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織與癌旁組織中miR-32和PTEN表達關系

miR-32在宮頸癌組織中高表達，而在癌旁組織中低表達；PTEN在宮頸癌組織中低表達，在癌旁組織中高表達，差異有顯著性意義（P＜0.05，圖 1）。

圖1 宮頸癌和癌旁組織中miR-32和PTEN表達關系

2.2 miR-32與PTEN表達關系

Hela-miR-32 inhibitors細胞株中，miR-32表達水平下調后，導致PTEN表達水平增高；Hela-miR-32 mimics細胞株中，提高miR-32表達水平后，PTEN蛋白水平下調，差異均有顯著性意義（P＜0.05，圖2）；而Hela和Hela-miR-NC比較，差異均無顯著性意義。

圖1 重組細胞系中miR-32與PTEN表達關系

4 討論

研究發現，PTEN基因在宮頸組織從癌前病變向宮頸癌演變的過程中有重要作用;PTEN基因的功能缺失使其對腫瘤細胞生長抑制及對細胞黏附的控制減弱，有助于宮頸癌的發生[3，4]。PTEN也可作為評價宮頸癌預后的指標[5]。本研究發現，宮頸癌組織中PTEN低表達，癌旁組織中高表達，兩者之間的差異有統計學。PTEN與宮頸癌發生發展有關。

研究表明，miRNA的表達異常與宮頸癌的發生、發展有著直接的聯系[6]。有研究發現，miRNA-27b在宮頸癌中表達增高，下調miRNA-27b表達水平后，宮頸癌細胞的生長受到明顯抑制[7]。本研究發現：宮頸癌組織中出現同時miR-32高表達和PTEN低表達，而癌旁組織中同時出現miR-32低表達和PTEN高表達。說明miR-32與PTEN表達均與宮頸癌發生發展相關，miR-32與PTEN表達具有負相關。同時，宮頸癌細胞中，miR-32表達下調后，導致PTEN表達水平增高；而提高miR-32表達后，PTEN蛋白水平下調，結合前期工作在生物信息學分析，本研究認為PTEN可能是miR-32的下游靶基因。他們之間的靶向結合與宮頸癌的關系值得進一步研究。