miR-1-3p在食蟹猴心肌損傷中表達水平及其與CK-MB、cTnI和NT-proBNP的相關性

姜惠敏，惠汝太，汪巨峰

0 引言

藥物致心臟毒性所引起的疾病即藥物性心肌病，是臨床醫生用藥的常見問題。雖然藥物上市前經過非常嚴格的臨床前和臨床安全評價，但是仍有很多治療性藥物因引起未預見的心血管毒性反應被召回或停用[1]，故篩選一種或幾種特異性藥物性心肌病的生物學標志物，對于降低藥物的死亡率和致殘率，提高新藥的臨床前安全性評價具有重要意義。由于目前藥物性心肌病常見的標志物肌鈣蛋白、肌酐激酶等，存在“滯后性”、“特異性和敏感性”尚較差的問題[2-3]，因此，尋找和發現理想的藥物致心臟毒性生物標志物，以便用來預測和發現藥物致心臟毒性反應已勢在必行。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種包含19～25個核苷酸序列的高度保守非編碼小RNA，其主要通過抑制mRNA的翻譯或影響mRNA的穩定性發揮其生理作用[4]。目前，循環miRNA作為癌癥、心肌損傷、腎臟損傷和肝臟損傷檢測的潛在標志物已經得到初步驗證并被認可，然而，在藥物致心臟損傷中，循環miRNA作為生物學標志物的研究尚剛起步，其應用于臨床前和臨床藥物的安全評價還需要進一步研究和定性[5-8]。miR-1在調控心臟發育和參與相關疾病發生過程中具有重要意義，是心臟特異性表達最高的miRNA之一[9-11]，多項研究表明，miR-1不僅在心血管系統發育、血管生成過程中發揮作用，而且參與了心肌梗死、心肌肥大、心肌纖維化和心臟重塑等病理過程[12-14]，但尚未檢索到在藥物致心臟毒性模型中miR-1表達相關文獻。本研究通過給予食蟹猴靜脈注射多柔比星造成心肌損傷模型，監測給予多柔比星的食蟹猴外周血循環中miR-1的變化，探討其在藥物致心臟毒性損傷診斷中的作用，以期為臨床前和臨床藥物引起心臟毒性檢測指標的應用提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 3～5歲普通級雄性食蟹猴(體重3.0～4.0 kg)17只，均購自北京協爾鑫生物科技有限公司[實驗動物生產許可證號：SYXK(J2015-0027)]；采用Toxstat 2006軟件，根據動物體重，按分層隨機化分組法分為2組，對照組7只，靜脈注射生理鹽水2.5 ml/kg每周，連續4周；實驗組10只，給予鹽酸多柔比星注射液2.5 mg/kg每周(浙江海正藥業股份有限公司，10 mg，批號:H44024359)，給藥體積2.5 ml/kg，連續4周。動物金屬籠單籠飼養，房間溫度16～26 ℃，濕度40%～70%，換氣次數8～10次/h，12 h照明，每天定量給食，自由攝食[實驗動物使用許可證號：SCXK(J2015-0011)]。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集及儲存 血標本采集：4周后采集食蟹猴外周血漿標本2.5 ml(需隔夜禁食)，其中0.5 ml置于冰上預冷的EDTA抗凝離心管中，30 min之內4 ℃離心后分離血漿(3 000×g，10 min)；剩余2 ml血液，不抗凝，自然放置30 min后，離心后輕取上層血液，以上樣本均放于-80 ℃凍存。心臟組織標本采集：處死食蟹猴取心臟后經液氮凍存和研缽磨碎或用組織勻漿器打碎后參照“1.2.2”項方法提取miRNA。

1.2.2 血漿及心臟組織中miR-1-3p的檢測 使用TaqmanTMmirVanaTM-PARISTMKit(Life Technologies公司)進行抽提。簡要步驟如下:取200 μl樣品于1.5 ml無RNase的離心管中，加入800 μl的TRIZOL試劑，混勻，室溫放置5 min；加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清于另一無RNase的離心管中，加入等體積的異戊醇，-20 ℃過夜；第2天4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；向沉淀中加入1 ml的75%乙醇，洗滌沉淀；棄上清，將沉淀晾干,加入30 μl的DEPC水溶解miRNA；按照miRcut miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作獲取cDNA[天根生化科技(北京)有限公司]；miRcut miRNA熒光定量檢測試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行實時定量PCR實驗。引物購自天根生化科技(北京)有限公司miRNA引物庫，選用U6作為內參。逆轉錄引物序列如下:miR-1-3p-3p,53-uggaauguaaagaaguauguau-74′;U6，5′-CGCTTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3′。反應條件：94 ℃ 5 min預變性，94 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s，40個循環。實驗數據使用ABI 7000軟件進行分析，將ΔCt值作為樣本表達量標準。

1.2.3 肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和N末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)的檢測 MILLIPLEX MAP Human CVD Panel 1(Cat. No. HCVD1MAG-67K，購自Merck millipore，內含CK-MB、cTnI、NT-proBNP檢測)，嚴格按試劑盒說明書操作，并運用液態懸浮芯片系統(LuminexTM200，美國)進行參數指標檢測和數據分析。

2 結果

2.1 食蟹猴心肌損傷模型的構建 由圖1可見，與正常對照組相比較，靜脈注射鹽酸多柔比星注射液的食蟹猴，心肌細胞發生變性和脂肪空泡化，甚至部分心肌細胞發生壞死，并有大量炎性細胞浸潤；且依據心臟組織病理學病變評分標準，提示模型建立成功。見圖1、表1。

圖1 食蟹猴心肌組織H&E染色

表1 食蟹猴靜脈注射表柔比星心臟組織病理學檢查結果

組織病理學改變對照組表柔比星(5 mg/kg)心臟空泡變性-(7/7)+(4/4)炎性細胞浸潤-(7/7)-(3/4)++(1/4)心肌壞死+(1/4)

2.2 多柔比星對食蟹猴血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平的影響 給予食蟹猴注射多柔比星4周后，血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平與對照組相比升高，分別是對照組的3.1、10.67、3.47倍，且兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 多柔比星處理4周后食蟹猴血漿中CK-MB、cTnI、NT-proBNP濃度的變化(pg/L)

注：與對照組比較，*P<0.05

2.3 多柔比星對食蟹猴血漿中miR-1-3p表達水平的影響 食蟹猴外周血血漿和心臟組織中miR-1-3p的表達水平在給藥4周后均顯著升高，分別是對照組的532.8%和237.5%，其表達水平與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組食蟹猴外周血漿和心臟組織中miR1相對表達水平

2.4 食蟹猴血漿中miR-1-3p的表達水平與CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相關性 通過對食蟹猴外周血漿中miR-1-3p的ΔCt值與cTnI、CK-MB和NT-proBNP的相關性進行分析，結果顯示，藥物致食蟹猴心臟損傷模型中，外周血漿中cTnI、CK-MB、NT-proBNP和miR-1-3p在給藥4周后，表達水平均迅速升高，并具有明顯相關性。見表3。

表3 血漿中miR1的ΔCt值與CK-MB、cTnI、NT-proBNP的相關性分析

3 討論

藥物引起潛在的心臟毒性已引起世界各國藥品監管部門、制藥企業和臨床醫生的高度關注。目前因藥物引起心臟毒性損傷而撤市和停止使用及導致患者死亡的概率，已經超越肝、腎毒性引起的臟器損傷，據中國衛生部藥物不良反應監察中心推算結果顯示，中國因藥物不良反應相關疾病而入院的患者中，因心臟毒性造成的死亡率為5.16%。蒽環類抗生素是臨床廣泛應用的藥物之一，其可引起不可逆心臟毒性，目前主要通過心臟功能指標進行心臟毒性的無創監測，尚無明確的早期血清學指標。

藥物引起心臟毒性可能與氧化應激、鈣超載、炎癥反應、氧自由基引起的心肌損傷機制有關，目前比較成熟的標志物包括血漿酶學標志物(CK-MB等)、炎性反應標志物(CRP等)、心肌缺血壞死標志物(cTnT等)，有的敏感性較好而特異性欠佳，有的釋放早，但出現的窗口期短。近年研究表明，miR-1在急性心肌梗死早期階段表達升高，且與CK-MB等指標趨勢一致[15]，研究發現，FABP3是miR-1調控的一個靶點[16]。食蟹猴是各項指標最接近人體的靈長類動物，但有關miR在藥物所致心臟毒性損傷的食蟹猴外周血中的表達水平尚未見報道。

cTnI、CK-MB、NT-proBNP濃度均具有高度的心肌特異性[17]，在心肌受損的情況下逸出而導致血漿中濃度增高，是心肌損傷最特異和敏感的標志物之一，目前已較廣泛應用于臨床診斷。本研究觀察了食蟹猴給藥發生心肌損傷后血漿中cTnI、CK-MB和NT-proBNP蛋白的變化，結果發現，在心肌受損第4周，血漿中CK-MB、cTnI和NT-proBNP的含量均明顯升高，驗證了cTnI、CK-MB和NT-proBNP可作為藥物致心臟損傷的生物學標志物。

Kuwabara等[18-19]研究發現，在不穩定型心絞痛患者的血漿中，miR-1的升高主要源于損傷的心肌細胞，且其表達水平上調與心肌的缺血應激相關，miR-1在缺血預適應對心肌的保護機制中起重要作用。本研究采用Real-time PCR法，測定給藥4周后食蟹猴外周血漿中miR-1-3p的表達水平，發現實驗組miR-1-3p的水平是對照組的532.8%，并推測血漿miR-1-3p表達水平升高的機制與缺血心肌細胞釋放增加有關，心臟組織中miR-1-3p升高為對照組的237.5%，結合相關性分析結果，提示miR-1-3p有可能作為診斷和預測藥物引起心肌損傷的潛在標志物。

綜上所述，本研究結果證實，食蟹猴心肌損傷模型中，其外周血漿中的miR-1-3p表達量顯著高于對照組，且血漿中miR-1-3p表達水平的變化與cTnI、CK-MB和NT-proBNP呈顯著正相關，提示miR-1-3p在血漿中表達水平的變化有可能作為藥物引起心肌損傷的分子標志物或聯合檢測標志物；且由于Real-time PCR法測定miR-1-3p簡單易行，血漿無須特殊處理，有較好的臨床應用前景。但該指標存在檢測費用較高等問題，而且作為生物標志物，miR-1-3p評價藥物引起心臟損傷的作用是否更優于現有的生物標志物如pro-BNP等，以及其在藥物引起心臟毒性損傷過程中的具體作用機制尚不完全明確，這些都有待進一步研究的證實和大量數據進行驗證。