半連續液態深層發酵紅棗醋及其抗氧化活性

劉杰超，葛曉丹，呂真真，劉 慧，張春嶺，焦中高

（中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009）

果醋以水果或果汁為原料釀制而成，兼具水果和醋的營養與功能特性[1-2]，因此深受消費者青睞，成為功能性果蔬飲料和果品深加工的研究熱點。多種常見的水果，如蘋果、梨、桃、葡萄、柿、石榴、草莓、橙、檸檬等[3-7]都被開發成果醋或果醋飲料，賦予其獨特的營養價值和保健功能[8]。

紅棗是我國傳統的養生佳品，富含糖、有機酸、維生素、氨基酸、礦質元素[9-10]以及多酚、多糖、環核苷酸、三萜類化合物等營養物質和功能性成分[11]，具有補氣補血、防癌抗癌、保肝護肝、調節免疫等多種生理功效[12]，是人類健康飲食和研制開發功能性食品的重要原料。近年來隨著紅棗產量的快速提高和果醋飲料的興起，利用不同品種的鮮棗或殘次紅棗釀制棗醋成為研究的熱點，棗醋的釀造工藝得到了較多研究。楊小波等[13]采用滬釀1.01醋酸菌，通過正交試驗確定靈武長棗醋醋酸發酵的最佳工藝參數；王世忠等[14]采用木醋桿菌發酵冬棗酒，得到酸度為5.2 g/100 mL、棗香濃厚的冬棗醋；諶井岡[15]采用液態表面靜態發酵法生產紅棗醋，發酵時間較固態發酵大為縮短，而風味物質含量較液態深層發酵增加。但這些研究多集中于間歇式發酵方式，周期較長。半連續液態深層發酵是在發酵后期通過周期性的排放發酵液同時補入新鮮料液的發酵方式，有利于維持醋酸菌的發酵能力，避免菌種老化，減少代謝阻遏，也不需要嚴格的無菌條件，因此在生產食醋或果醋方面得到廣泛應用[16]。向進樂等[17]以殘次鮮棗為原料，采用半自動連續醋酸發酵法釀制棗醋，證實該方法可用于快速釀造紅棗醋，但未對不同工藝條件的影響進行進一步研究。已有研究表明，果醋發酵受原料、菌種、溶氧量以及發酵方式等的影響，尤其是溶氧量，對于醋酸菌的生長和醋酸發酵具有決定性作用[18]。

本研究以新疆灰棗釀制的紅棗酒為原料，采用半連續液態深層發酵，探討不同接種量和溶氧條件對紅棗酒醋酸發酵的影響，并對不同發酵批次紅棗醋的多酚含量和抗氧化活性進行比較分析，以期為紅棗醋的連續快速發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗酒：以新疆灰棗為原料，加3倍水煮制、打漿，接入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵后經過濾、澄清得到，酒精度為14%vol，總糖含量2.93 g/100 mL，pH為3.74。

醋酸菌菌種：巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01，上海佳民釀造食品有限公司。

醋酸菌培養基：葡萄糖1.00 g，酵母膏1.00 g，無水乙醇3.5 mL，碳酸鈣2.00 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，調pH值至6.8。

醋酸菌活化培養基：葡萄糖1%，酵母膏1%，調pH值至4.5，121 ℃滅菌20 min，使用前添加3%乙醇。

2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-酚試劑、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2,2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid）diammonium salt，ABTS]、沒食子酸、蘆丁、乙酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸（均為分析純）：美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Biotech-10BG發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；ZHWY-2112B恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；1525高效液相色譜（high performance liquid chro matography，HPLC）儀：美國Waters公司；SPECORD 50型紫外/可見分光光度計：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與種子液培養

醋酸菌斜面保藏菌種經轉接活化后接入液體活化培養基，在30 ℃條件下振蕩培養48 h，然后以10%的接種量接入4%vol棗酒，馴化培養48 h，至產酸量為（1.3～1.5）g/100 mL，作為種子液。

1.3.2 單批次發酵試驗

（1）接種量對紅棗酒醋酸發酵的影響

10 L發酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調整酒精度為6%vol），分別按照10%、20%接種量接入培養好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧10%，攪拌轉速500 r/min，在28 ℃條件下發酵，每間隔一定時間取樣測定總酸含量，考察不同接種量對紅棗酒醋酸發酵的影響。

（2）溶氧量對紅棗酒醋酸發酵的影響

10 L發酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調整酒精度為6%vol），按照20%接種量接入培養好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧量分別為5%、10%和15%，攪拌轉速500 r/min，在28 ℃條件下發酵，每間隔一定時間取樣測定總酸含量，考察不同溶氧量對紅棗酒醋酸發酵的影響。

1.3.3 棗醋發酵過程中有機酸組成變化

10 L發酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調整酒精度為6%vol），按照20%接種量接入培養好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧10%，攪拌轉速500 r/min，在28 ℃條件下發酵，發酵17 h后每間隔2 h取樣分析有機酸組成，考察紅棗酒醋酸發酵過程中有機酸的變化。

1.3.4 分割留種半連續發酵試驗

使用10 L發酵罐，初始棗酒酒度4%vol，裝液系數60%，攪拌轉速500 r/min，控制通氣量保持溶氧10%，溫度28 ℃條件下發酵。當通氣量不變條件下溶氧開始上升時出醋，并補充棗酒進行下一批次發酵。發酵過程中每間隔一定時間取樣測定總酸含量，分別考察40%和50%留種量對發酵進程的影響以及醋酸發酵的穩定性。

1.3.5 分析方法

總酸含量測定參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》，以乙酸計?？偡硬捎肍olin-酚法[19]測定，以沒食子酸為標準品制作標準曲線計算含量。總黃酮采用硝酸鋁比色法[20]測定，以蘆丁為標準品制作標準曲線計算含量。

有機酸組成分析采用高效液相色譜法[21]，以乙酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸為標準品采用外標法測定發酵液中有機酸的組成與含量。

1.3.6 抗氧化活性測定

分別采用DPPH自由基清除法[22]、鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法[23]和ABTS自由基清除法[24]進行抗氧化活性測定，以抗壞血酸（vitamin C，VC）為標準品制作標準曲線計算抗氧化活性，結果以VC當量表示。

1.3.7 數據處理

采用Excel和SPSS22.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單批次發酵試驗

2.1.1 接種量對紅棗酒醋酸發酵的影響

接種量為10%和20%時的醋酸發酵曲線見圖1。前20 h以內發酵緩慢，21 h之后產酸量及產酸速率均快速增加，至27～31 h時產酸速率達到高峰，其后急劇下降，從而導致總酸含量在33～35 h時基本趨于穩定。當接種量為20%時，發酵遲滯期明顯縮短，15 h之后就開始快速產酸，27 h后產酸速率大幅下降，總酸含量基本趨于穩定，說明已接近發酵終點。但從最終產酸量來看，二者之間無顯著差異。

圖1 接種量對紅棗酒醋酸發酵的影響Fig.1 Effect of inoculum on acetic acid fermentation of jujube wine

2.1.2 溶氧對紅棗酒醋酸發酵的影響

醋酸發酵是一個需氧過程，溶氧條件對醋酸菌生長和酒精醋化都具有重要影響[23]。不同溶氧條件下的醋酸發酵曲線見圖2。

由圖2可知，隨著溶氧量的增加，發酵進程加快，15%溶氧量最早到達發酵終點，但由于通氣量加大造成乙醇和乙酸損失，導致最終產酸量較低。5%溶氧量與10%溶氧量到達發酵終點的時間相近，但最終產酸量略低于10%溶氧量。這可能是因為供氧量過低限制了醋酸菌的生長和發酵。

不同溶氧條件對產酸速率的影響見圖3。由圖3可知，從產酸速率來看，19h以前不同溶氧量之間差異顯著（P＜0.05），溶氧量越高，產酸速率越大。但15%溶氧量在19 h之后即進入穩定產酸期，一直到25 h后產酸速率大幅降低，接近發酵終點。而5%和10%溶氧量在21 h之后產酸速率變化趨于一致，23 h之后進入穩定產酸期，27 h后產酸速率大幅下降，接近發酵終點。由于前期5%溶氧量產酸速率較低，因此整個發酵過程其平均產酸速率也低于10%溶氧量。綜合考慮產酸量和產酸速率，溶氧量以10%為宜。

圖3 不同溶氧量對產酸速率的影響Fig.3 Effect of dissolved oxygen amount on acid production rate

2.2 棗醋發酵過程中有機酸組成變化

有機酸是果醋中最重要的風味成分和營養物質，其中醋酸是發酵過程中生成的最主要的有機酸，也是果醋的特征性成分。為了解紅棗醋發酵過程中醋酸的形成規律以及其他有機酸的代謝情況，對棗醋發酵過程中有機酸的組成進行了分析，結果見表1。

表1 紅棗酒醋酸發酵過程中有機酸組成的變化Table 1 Changes of organic acid profile during acetic acid fermentation of jujube wine mg/100 mL

由表1可知，棗醋發酵液中主要含有乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和少量莽草酸、富馬酸。乙酸是棗醋及其發酵液中最主要的有機酸，而且在發酵過程中一直呈快速增加趨勢，發酵結束時乙酸含量達到4 812.35 mg/100 mL，是初始發酵時的23.97倍，占總有機酸的比例也從38.21%提高至94.58%，說明乙酸是發酵過程中的主要產物。除乙酸外，奎寧酸含量在快速產酸初期也增加一倍以上，但隨后又逐漸降低，至發酵末期又恢復到醋酸發酵前的水平。而蘋果酸含量則是在發酵前期大幅提升，進入快速產酸期后又快速降低到醋酸發酵前的水平。乳酸含量在醋酸發酵初期顯著下降（P＜0.05），其后基本維持穩定，發酵結束時降低至43.55 mg/100 mL。酒石酸、檸檬酸、莽草酸、富馬酸含量在發酵過程中變化很小。向進樂等[25]在桃醋液態發酵的研究中也發現，蘋果酸含量在醋酸發酵前期大幅升高，其后又逐漸降低，而乳酸含量則在整個醋酸發酵階段一直呈降低趨勢。這可能是因為在醋酸菌快速生長與發酵過程中需要大量的能量，蘋果酸、乳酸和奎寧酸作為營養物質被代謝或轉化[26]。

圖4 紅棗醋半連續液態深層發酵曲線Fig.4 Curves of semi-continuous submerged fermentation of jujube vinegar

2.3 分割留種半連續發酵

考慮到醋酸菌在連續發酵過程中一直處于高酸環境中對醋酸菌生長不利，因此采用4%vol棗酒進行分割留種半連續發酵試驗，既能達到總酸含量≥3.5%的要求，又可保持醋酸菌的旺盛生長和發酵能力。留種50%和40%條件下的半連續發酵曲線見圖4。

由圖4A可知，在連續4個批次的發酵中，產酸規律基本一致，發酵周期在14.5～15.5 h，總酸含量在3.77～3.95 g/100 mL。說明分割留種可以實現穩定連續快速發酵。降低留種量會導致發酵周期的延長。由圖4B可知，40%留種量條件下遲滯期大幅延長，從而導致發酵周期較50%留種量延長一倍左右，但對產酸水平影響不大，發酵棗醋總酸含量可達3.78～3.92 g/100 mL。因此，在分割留種半連續發酵生產中，必須綜合考慮生產效率，兼顧發酵周期和出醋量，以確定適宜的留種量。

2.4 紅棗醋的酚類物質含量和抗氧化活性

為考察半連續發酵對紅棗醋中酚類物質含量及抗氧化活性的影響，對留種50%連續發酵的4個批次的醋的總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力、Fe3+還原能力、ABTS自由基清除能力進行測定，結果見表2。

表2 紅棗酒和不同批次紅棗醋的酚類物質含量和抗氧化活性Table 2 Total phenolics,flavonoids contents and antioxidant activity of jujube liquor and different batches of jujube vinegar

由表2可知，紅棗酒經過醋酸菌發酵后，紅棗醋中的總酚和總黃酮含量均有不同程度的提高，尤其是總黃酮含量，4個發酵批次紅棗醋較紅棗酒平均提高了42.98%，而且各批次紅棗醋與紅棗酒之間均有顯著差異（P＜0.05）；總酚含量較紅棗酒平均提高16.59%，除第1批次外，其他各批次紅棗醋與紅棗酒之間均有顯著差異（P＜0.05）。用DPPH法、FRAP法和ABTS法測定的紅棗醋的抗氧化活性和原來的紅棗酒相比也分別增加了24.66%、27.87%和38.07%。這說明紅棗酒經醋酸菌發酵可提高其酚類物質含量和抗氧化活性。其原因可能是發酵過程中微生物的作用促進了酚類物質的溶出或者生物轉化導致一些酚類物質或抗氧化成分的生成。ZOU B等[27]在對柿醋發酵過程的研究中也發現，醋酸發酵可顯著提高其ABTS自由基清除能力（P＜0.05），但總酚含量沒有顯著差別。枳椇酒經醋酸發酵后，總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力均得到明顯提高[28]。這都與本研究結果相似，也說明醋酸菌發酵可作為提升果蔬加工產品功能特性的一個重要手段。

3 結論

采用半連續液態深層發酵法可快速釀制紅棗醋，溶氧量以控制在10%左右為宜，分割留種量50%時發酵周期為14.5～15.5 h，較分割留種量40%時縮短一半左右。紅棗酒醋酸發酵初期伴隨奎寧酸和蘋果酸含量的大幅增加，但在后續的快速產酸階段又逐漸降低至發酵前的水平，而乳酸含量在醋酸發酵初期即快速降低，而后保持平穩。棗酒經過醋酸菌發酵后，其中的總酚和總黃酮含量以及抗氧化活性均得到不同程度的提高，因此可以作為增強紅棗產品功能特性的加工手段。