葉幕形和留穗量對赤霞珠葡萄酒單體酚類物質的影響

楊 君，李俊楠，任瑞華，寧鵬飛，張振文*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.山西堯京酒業有限公司，山西臨汾 041500）

酚類物質影響葡萄和葡萄酒的顏色和苦澀感，是評價葡萄和葡萄酒質量的重要指標，同時酚類物質具有抗氧化、抗菌、抗癌等特性，有利于人體健康[1-3]。葡萄酒中單體酚類物質可分為單體花色苷類與單體非花色苷類，單體非花色苷類主要包括酚酸、黃酮醇、黃烷醇以及芪類物質[4]。抗氧化劑主要是通過抑制氧化鏈反應的開始或者擴散來抑制其他分子的氧化，有利于緩解氧化性疾病（心血管疾病、癌癥等）帶來的傷害[5-6]，葡萄酒中酚類化合物因其抗氧化特性而受到越來越多的關注[7-8]。葡萄及葡萄酒中含有大量的酚類物質，葡萄酒中酚類物質主要通過浸漬作用從葡萄中獲取[9]，葡萄果實中的酚類物質分布在葡萄種子和果皮中，其含量主要與葡萄品種、栽培條件、氣候條件、整形方式等有關[10]。通過合理的整形方式來提高葡萄品質是一種簡單易行的方式，有研究發現整形方式對葡萄品質的影響主要表現在兩方面，一是葉幕形，二是果穗負載量，兩者均可不同程度的改變釀酒葡萄果實生長的微環境，進而影響葡萄產量和果實品質[11]。

葉幕形是葡萄栽培管理的一項重要管理措施，合理的葉幕形有利于獲得穩定的產量、提高果實品質、病蟲害的防治[12]。不同的架式能形成不同的葉幕結構，從而調節葉幕冠層的光照分布，改變葉片的光合面積，調節樹體營養生長與生殖生長的關系[13]。籬形架形成直立葉幕廣泛應用于釀酒葡萄栽培管理中，Y形架形成V形葉幕，在鮮食葡萄的栽培中廣泛被應用，有研究表明，將籬形架改造為Y形架栽培，使葉幕分開，可有效提高葉片光合效率，改變樹體生長狀況以及產量，有利于提高果實成熟度，減輕病蟲害[14]。

對于釀酒葡萄，產量是決定葡萄成熟度的主要因素，要獲得較高的可持續產量的同時并具有理想的成熟度，對葡萄植株產量的控制極為重要[15]。疏穗是管理葡萄產量的重要措施，通過對葡萄進行疏穗管理去除葡萄植株上一部分果穗，在不減少葉面積的同時限制植株產量，將植株所產生的能量集中在剩余果穗，使葡萄在較差的氣候條件下也能達到生長所需成熟度[16]，而葡萄果實的成熟程度不僅會影響成熟葡萄漿果中糖、酸、多酚以及香氣物質含量[17]，還會影響葡萄酒的顏色以及葡萄酒中化合物的成分，對于提高葡萄酒質量至關重要[18]。關于葡萄酒中酚類物質成分含量及其抗氧化性的研究越來越多[19]，但在釀酒葡萄栽培過程中，關于葡萄果穗數量與葉幕形對葡萄酚類物質的組成及含量的研究相對較少。

晉中南地區是我國新興的葡萄酒產區，赤霞珠是該地區的主栽品種，本試驗通過葉幕形與果穗留量對赤霞珠干紅葡萄酒中單體酚類物質的影響進行研究，并對成熟葡萄果實的單株產量、成熟度、酚類物質含量進行測量，對所釀葡萄酒的基本理化指標進行檢測，分別采用高效液相色譜-質譜聯用技術（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS），對葡萄酒中單體酚類物質種類與含量進行檢測，探討葉幕形與果穗留量對干紅葡萄酒質量的影響，以期通過合理整形修剪方式，提高晉中南地區赤霞珠葡萄酒的品質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

試驗所用葡萄植株為2012年定植的赤霞珠自根苗，南北行向，行間距為3 m，株距為1 m，單籬架，整形方式為廠字形，短枝修剪，葡萄園采用半機械化管理。田間試驗于2018年進行。

1.1.2 試驗地概況

試驗地位于山西省臨汾市襄汾縣堯京酒莊（35.7～36.1°N，111.1～111.7°E），海拔500～600 m，平地，基本處平原地區。該地區屬溫帶季風氣候，暖熱多雨，雨熱同季。年均氣溫11.5 ℃，年降水量550 mm左右，無霜期185 d，氣象數據均來自于中國氣象數據網（http：//data.cma.cn/）。

1.1.3 化學試劑

甲醇、甲酸、乙腈、4-甲基-2-戊醇、甲基纖維素、（+）-兒茶素、干沒食子酸、二甲花翠素、原花色素B1、槲皮素等標品（均為色譜級）：美國Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖、氫氧化鈉、甲氨基肉桂醛（4-（dimethylamino）cinnamaldehyde，DMACA）、濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LE438pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；PAL-1數字手持折糖儀：日本愛拓公司；AUW220D電子天平：日本島津公司；KQ-300DE型數控超聲器：昆山市超聲儀器公司；Aligent 1100、1200 系列高效液相色譜-質譜聯用儀、Kromasil 100-5C18column色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

本試驗于2018年春季分別對試驗園原葡萄樹形（籬形架直立形葉幕，廠字形，新梢留量約每米架面10個，單株果穗數為20（圖1））的果穗留量與葉幕形加以改造。對果穗留量進行改造如下：新梢留量為每米架面10個，果穗留量設3個水平，即單株果穗數為10個（F1）、15個（F2），并以原單株果穗數20個為對照（CK），每處理分3小區，每個小區30株，隨機區組排列。

對葉幕形進行改造情況如下：通過搭架將新梢向兩邊綁縛設置Y形架（圖1），形成V形葉幕，開張角度為60°，葉幕傾斜長度為120 cm，葉幕厚度為30 cm，Y形架兩橫擔距地面從下到上分別為110 cm和150 cm，對應橫擔上鐵絲間距分別為50 cm和85 cm，并與原籬形架形成的直立葉幕進行對比，兩種葉幕形下每延長1 m架面均留新梢10個，單株果穗數為20，其他栽培管理方式均一致。

圖1 Y形架與籬形架模式圖Fig.1 Pattern diagram of Y-shaped frame and vertical frame

1.3.2 果實采樣與葡萄酒的釀造

各處理于9月24日采收，按照“S”形選取9株葡萄。每株葡萄分別在陰面與陽面的上、中、下部各選一穗，然后在每穗葡萄上邊均勻選取5粒，共選取54穗，共計270粒葡萄，立即帶回實驗室，將其放置在-40 ℃條件下進行保存，儲藏用于測量果實中可溶性固形物、可滴定酸、酚類物質含量及pH值。對每個小區30株樹上的果穗全部進行采摘并稱質量，計算單株平均產量。

1.3.3 小容器發酵

采用小容器（20 L玻璃罐），參考MULERO J等[20]改進的干紅葡萄酒發酵工藝進行釀造。每個處理稱取20 kg果穗，人工除梗破碎后入20 L的玻璃罐，立即加入60 mg/L的SO2攪勻，1 h后加20 mg/L果膠酶，溫度控制在25 ℃，24 h后加入200 mg/L活化后的干酵母（酵母名稱為LAFASE HE GRAND CRU）進行酒精發酵，使用干凈的紗布蓋住玻璃罐罐口，早晚各壓帽一次，并測量其比重和溫度，比重降至1.000時進行皮渣分離，繼續發酵至比重降至0.992～0.996，并基本不變時加入60 mg/L的SO2終止發酵，并滿罐密封15 d，之后裝瓶并陳釀120 d。

1.3.4 葡萄和葡萄酒中基本理化指標的測定

葡萄中可溶性固形物、可滴定酸、pH值以及葡萄酒中殘糖、酒度、揮發酸、總酸含量均參照王華[21]的方法。葡萄果實中總酚類物質的測定采用福林-肖卡法[22]；總花色苷含量的測定采用pH示差法[23]；總類黃酮含量的測定采用蘆丁-甲醇顯色法[24]，采用p-DMACA-鹽酸法測量總黃烷醇含量[25]。

1.3.5 單體酚類物質的測定

單體花色苷物質檢測采用Agilent 1100 系列LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質譜聯用儀，配有二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）。流動相A：甲酸/乙腈/水=2/6/92（V/V/V），流動相B：甲酸/乙腈/水=2/54/44（V/V/V）。流動相B洗脫程序如下：1～18 min，10%～25%；18～20 min，25%；20～30 min，25%～40%；30～35 min，40%～70%；35～40min；70%～100%，流速為1.0mL/min；進樣量為30μL，每個樣品重復進2次。花色苷的定性研究根據中國農業大學葡萄酒中心建立的“葡萄與酒花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫”進行[26]。花色苷定量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計，其中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標物建立5～500 mg/L之間、9個梯度、3個重復的標準曲線，決定系數在0.999以上。

單體非花色苷酚類物質的檢測采用Agilent 1200系列LC/MSD高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀，可變波長檢測器，流動相A相為0.1%的乙酸水溶液，流動相B相為1%的乙酸乙腈溶液，進樣量為2 μL，流速為1 mL/min，每個樣品重復進2次[27]。非花色苷的定性與定量參考LIANG N N等[26]的方法進行，葡萄酒中非花色苷質量濃度單位用mg/L表示。

1.3.6 數據分析

數據分析采用Excel 2010以及SPSS Statistics 17.0軟件進行分析，用Duncan法進行多重比較，P＜0.05 表示差異達到顯著水平，運用Origin 8.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 葉幕形與果穗留量對葡萄單株產量及成熟度的影響

不同葉幕形和果穗留量對單株產量和成熟度的影響見表1。由表1可知，V形葉幕單株產量略低于直立形葉幕，但兩者差異不顯著（P＞0.05），V形葉幕葡萄果實中可溶性固形物含量比直立形葉幕顯著提高21.3%（P＜0.05），可滴定酸含量比直立形葉幕顯著降低10.9%（P＜0.05），這可能是因為葉幕張開可增加葡萄葉片的光照面積，有利于葡萄果實中糖分的積累[28]。對于留穗量，隨著單株果穗數量的減少，葡萄單株產量逐漸降低，但果實中可溶性固形物含量逐漸增加，這與前人研究一致[29]。果穗留量為10時，葡萄中可溶性固形物含量最高，但和果穗留量為15時無顯著性區別（P＞0.05），比果穗留量為20時顯著高12.9%（P＜0.05）。故適當的疏穗或利用V形葉幕栽培有利于提高葡萄的成熟度。

表1 不同葉幕形和果穗留量對單株產量和成熟度的影響Table 1 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on the yield per plant and ripeness

2.2 葉幕形與果穗留量對葡萄果實酚類物質的影響

對不同處理果實中酚類物質進行檢測，結果見表2。由表2可知，對于兩種葉幕形，葡萄果實中總酚、總類黃酮和總花色苷含量沒有顯著差別（P＞0.05），但V形葉幕果實中總黃烷醇物質含量比直立葉幕高9.7%，說明葡萄的葉幕張開，有利于葡萄果實中總黃烷醇物質的積累。果穗留量為10和15的成熟葡萄果實中總酚、總黃烷醇、總類黃酮和總花色苷含量均高于果穗留量為20的處理，故適當的減少葡萄植株的單株果穗數有助于提高葡萄果實中酚類物質含量，這可能是由于果穗數量的減少改善了樹體的庫源平衡，從而促進了風味物質的積累[30]。

表2 不同葉幕形和果穗留量對葡萄果實中酚類物質含量的影響Table 2 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on phenolic contents in grape fruits mg/g

2.3 葉幕形與果穗留量對葡萄酒常規理化指標的影響

不同葉幕形與果穗留量對葡萄酒理化指標的影響見表3。由表3可知，各處理所釀葡萄酒中酒精度和殘糖含量均符合國標要求。兩種葉幕形下所釀造的葡萄酒中殘糖、酒精度含量沒有顯著差別（P＞0.05）。對于果穗量，果穗留量為10時葡萄酒中殘糖含量比果穗留量為20和15時分別高2.1%、8.8%，但是差異并不顯著（P＞0.05），果穗留量為10時葡萄酒中總酸含量分別比果穗留量為15和20顯著高12.6%和23.3%（P＜0.05），表現為隨著果穗數量的增加呈現降低趨勢；果穗留量為20時酒精度分別比果穗留量為10和15顯著降低5.7%和5.8%（P＜0.05），這與其葡萄果實的成熟度有關，由于發酵作用可將葡萄汁中的糖轉換為酒精，由于果穗留量為20時果實成熟度較低，故其酒精度較低。

表3 不同葉幕形與果穗留量對葡萄酒理化指標的影響Table 3 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on physicochemical indexes of wine

2.4 葉幕形與果穗留量對葡萄酒單體酚類物質的影響

2.4.1 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中花色苷單體酚類物質的影響

不同處理葡萄酒中單體花色苷含量以及種類比例如表4。由表4可知，兩種葉幕均檢測出7種花色苷單體，包括3種非酰化花色苷和4種酰化花色苷，其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷及其乙酰化合物所占比重較大，V形葉幕下葡萄酒中酰化花色苷和非酰化花色苷均顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中酰化花色苷含量（33.46 mg/L）是直立葉幕的2.8倍。V形葉幕下葡萄酒中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷均顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（72.54 mg/L）是直立葉幕（38.61 mg/L）的1.9倍。酰化花色苷有助于增加葡萄酒顏色的穩定性，甲基化含量有助于提高葡萄酒中紅色色調[31]，故采用V形葉幕栽培所釀造葡萄酒顏色較深且穩定性較好。

對于不同的果穗量，各處理均檢測出7種花色苷單糖苷，酰化花色苷占花色苷總量的20%～30%，其中甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷在果穗留量為20的處理中含量極低。葡萄酒中單體花色苷總量表現為果穗留量為15（103.32 mg/L）＞果穗數量為10（99.85 mg/L）＞果穗數量為20（50.73 mg/L），當果穗數量為15時，酰化單體花色苷含量（29.52 mg/L）是果穗留量為20（11.95 mg/L）的2.50倍，但與果穗留量為10時差異不顯著（29.38 mg/L）（P＞0.05）。果穗留量為15的處理二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量（72.01 mg/L）是果穗留量為20（38.61 mg/L）的1.90倍，比果穗留量為10時（68.76 mg/L）高4.73%，但差異不顯著（P＞0.05）。果穗留量為10時二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷含量（25.29 mg/L）分別是果穗留量為20（10.15 mg/L）的1.50倍，比果穗留量為15時（10.15 mg/L）顯著提高8.9%（P＜0.05）。這可能與疏穗增加了果穗的受光面積，提高了葡萄成熟度，從而有利于單體酚類物質的合成以及花色苷的積累有關[32]。葡萄酒中在葡萄酒釀造過程中，若葡萄具有較高的成熟度，會增大葡萄細胞壁的降解，使葡萄果皮中花色苷更容易被提取到葡萄酒中[33]，果穗留量為20的處理，葡萄果實成熟度低于果穗留量為10和15的處理，不利于果皮中花色苷的提取。綜上所述，減少果穗留量或采用V形葉幕栽培均有利于葡萄酒中單體花色苷含量的提高，提高葡萄酒顏色的穩定性。

表4 不同葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體花色苷物質的影響Table 4 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on anthocyanins in wine

2.4.2 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中非花色苷單體酚類物質的影響

葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體非花色苷物質的影響見表5。由表5可知，不同處理均檢測出10種非花色苷單體物質，主要包括3種黃烷醇類物質、3種酚酸類物質以及4種黃酮醇類物質，三類物質在葡萄酒中所占總量比例基本一致，其中黃烷醇類物質占非花色苷單體總量的10%左右，酚酸類物質占非花色苷單體總量的15%左右，黃酮醇類物質占非花色苷單體總量的75%左右。對于不同的葉幕形，V形葉幕非花色苷單體總含量（286.25 mg/L）是直立葉幕（194.19 mg/L）的2.18倍，黃烷醇類總量和黃酮醇類總量均表現為V形葉幕顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），這與V形葉幕分開，減少了果實和內部葉片的遮蔽，從而有利于果實著色以及果實糖含量的積累有關[34]。此外，葡萄果實曝光面積的增加會增加黃酮醇與花色苷共同色素沉著現象，從而提高葡萄或葡萄酒中黃酮醇類物質含量[35]。

表5 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體非花色苷物質的影響Table 5 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on non-anthocyanins in wine

對于單株果穗數，非花色苷單體總含量隨著果穗數量的增加逐漸降低，其中果穗數量為10（416.23 mg/L）和15的處理（380.70 mg/L）非花色苷總量分別是新梢留量為20（194.87mg/L）的2.10倍和1.90倍。果穗留量為10（338.44mg/L）和15（313.82 mg/L）時葡萄酒中黃酮醇類物質總量分別是果穗留量為20（142.00 mg/L）的2.38和2.21倍，果穗量為10和15時葡萄酒中黃烷醇類物質總量分別比果穗量為20時顯著高72.4%和44.4%（P＜0.05），故適度的減少果穗數有利于黃酮醇和黃烷醇類物質的積累。

3 結論

本試驗以赤霞珠為試材，進行小容器發酵實驗，主要研究葉幕形與果穗留量對葡萄酒中單體酚類物質的影響，結果表明，在V形葉幕下，葡萄果實的成熟度較好，葡萄酒中花色苷單體酚類物質與非花色苷單體酚類物質均顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中酰化花色苷含量是直立形葉幕的2.80倍，葡萄酒呈色較好。對于籬形架栽培的葡萄，適當的減少果穗有利于提高葡萄果實的成熟度和葡萄酒中單體酚類物質含量，其中當單株果穗數為15時，葡萄酒中單體花色苷含量最高。綜上所述，在山西晉中南地區，對于釀酒品種赤霞珠而言，適度的降低單株果穗留量或者改造為V形葉幕栽培，有利于提高葡萄酒中單體酚類物質含量。