山楂果肉中多酚閃式提取工藝的研究

李 麗，袁建琴，王文斌

（山西農業大學生命科學學院，山西晉中 030801）

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）是薔薇科山楂屬果實，又名山里果、山里紅，是中國特有食藥兩用的樹種[1]。其藥用歷史已有兩千多年，可以抗氧化、降低血脂血糖[2-4]，也是健脾開胃、消食化滯的良藥，對胸膈脾滿、疝氣等也有好的療效[5-8]。

多酚是在植物性食物中發現的，別稱為植物單寧，它的抗氧化功能可以對慢性病起到預防效果。一般存在于一些常見的植物性食物中，如可可豆、茶、蔬菜和水果，在山楂中也能提取到[9-10]。李啟彭等[11]在用超聲波法提取的山楂果肉中多酚含量為19.741 mg/g，果皮中多酚含量為67.148 5 mg/g，試驗結果表明，在12種水果中，山楂的多酚含量最多，且果皮的多酚含量高于果肉。柳偉等[12]在用超聲波法測定12種種皮多酚的研究中得出山楂皮中的多酚含量最多，為44.83mg/g。閃式提取根據組織破碎提取原理，其一次提取常在數秒至幾分鐘即可完成，適用于酶、多酚類等穩定性差的成分。王明華等[13]認為閃式提取法可將細胞完全打破，更有利于提取。

該試驗旨在利用閃式提取法快的特點來提取測定山楂果肉中的多酚的含量，探討提取時間、料液比、電壓這些條件對提取率的影響，依據其性質，在單因素提取條件基礎上，采用響應面優化設計考察幾個關鍵因素在閃式提取中對多酚得率的影響，篩選出山楂多酚的最佳提取條件，為今后對山楂活性成分的提取及功能的深入研究奠定基礎，對于提高山楂的經濟價值、拉長山楂產業鏈有重要的意義[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：市售。沒食子酸標準品（純度≥98%）、福林酚、無水乙醇（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

JHBE-50T中草藥閃式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SBZ-019中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；GZX-9023MBE數顯鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；7200-型分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；ZF-20L抽濾真空泵：鄭州市亞榮儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

將山楂洗凈，然后人工去核，將去過核的山楂果肉置于60 ℃烘箱中烘干至質量恒定，用粉碎機粉碎，過80目篩，保存備用。

1.3.2 標準曲線的繪制

分別精密吸取沒食子酸標準品母液0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL于6個10 mL的容量瓶中，用體積分數60%的乙醇溶液定容，得到質量濃度分別為0、0.024 mg/mL、0.048 mg/mL、0.072 mg/mL、0.096 mg/mL、0.120 mg/mL的沒食子酸待測液，用移液槍吸取6個容量瓶中的待測液0.2 mL于6個試管中，再分別加入1 mL 10%福林酚顯色劑，5 min后加入3 mL飽和Na2CO3溶液，振蕩搖勻，使其在室溫條件下黑暗反應1 h，于波長765 nm處測定吸光度值。以沒食子酸質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標繪制標準曲線。沒食子酸標準曲線為Y=4.113 1X+0.026 4（R2=0.991 4），線性關系良好。

1.3.3 多酚閃式提取工藝優化單因素試驗

料液比的確定：稱取1 g山楂粉于5個試劑瓶中，按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）加入體積分數60%的乙醇溶液于試劑瓶中，搖勻，室溫（25 ℃）條件下用閃式提取器在提取電壓100 V條件下提取60 s，5 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于10 mL容量瓶中，體積分數60%的乙醇定容。分別從容量瓶中吸取0.2 mL溶液，后續步驟同1.3.2，以體積分數60%的乙醇溶液作為空白對照[16]。同理，依次考察提取時間（60 s、70 s、80 s、90 s、100 s）、提取電壓（100 V、110 V、120 V、130 V、140 V）對多酚得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計[17]

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Benhnken原理，選取料液比（A）、提取時間（B）和提取電壓（C）3個因素，以多酚得率（E）為響應值，采用3因素3水平的響應面分析方法進行試驗設計，以獲得最佳的提取條件[18]。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 山楂果肉中多酚閃式提取工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp

1.3.5 多酚得率的測定方法[19]

吸取0.2 mL已制備好的多酚提取液，采用和標曲制作相同的方法測定樣品吸光度值A；求山楂粉末中多酚的質量濃度C；山楂多酚得率計算公式如下：

式中；E為山楂多酚得率，mg/g；C為多酚質量濃度，mg/mL；V為樣液體積，mL；M為山楂粉末質量，g。

1.3.6 數據處理

使用DesignExpert8.0軟件處理與分析響應面試驗數據。

2 結果與分析

2.1 多酚閃式提取工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 料液比對山楂果肉中多酚得率的影響

圖1 料液比對山楂果肉中多酚得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖1可知，隨著料液比的不斷增加，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢，料液比為1∶40（g∶mL）時，多酚得率最高為36.33 mg/g。其原因可能是提取時的液體較多，濃度相對減小，導致刀片與山楂的剪切率下降，使山楂中多酚的有效成分提取不完全，也可能是其他物質的溶出而抑制了多酚的提取。由此確定，1∶40（g∶mL）是提取多酚的最佳料液比。

2.1.2 提取時間對山楂果肉中多酚得率的影響

圖2 提取時間對山楂果肉中多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖2可知，隨著提取時間的不斷延長，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢，提取時間為80 s山楂樣品溶液的多酚得率達到最大，為35.27 mg/g，繼續增加提取時間后多酚得率逐漸下降，分析原因可能在提取的過程中刀頭不斷剪切，產生較多熱量，繼而隨著提取時間的延長，溶液溫度升高很快，不穩定的化學成分易發生變化[10]，由此確定80 s為最佳提取時間。

2.1.3 提取電壓對山楂果肉中多酚得率的影響

圖3 提取電壓對山楂果肉中多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖3可知，隨著提取電壓的不斷升高，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趨勢，當閃式提取電壓達到110 V時，多酚得率最大，為34.92 mg/g，這可能是由于在高速電機的帶動下，內外刀在高速旋轉的過程中影響了某一部分多酚的內部結構，導致得率減少。因此，山楂在該條件下最佳提取電壓為110 V。

2.2 響應面試驗設計結果[20-22]

響應面試驗設計及結果見表2。

表2 山楂果肉中多酚閃式提取工藝優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp

續表

通過統計分析軟件Design-Expert 8.0進行數據分析，建立二次響應面模型為：E=42.72+0.76A-0.91B+1.39C-2.38AB-1.89AC+0.037BC-4.11A2-6.14B2-3.43C2。回歸分析與方差分析結果及交互作用的響應面分析結果分別見表3和圖5。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型的F值為107.76（P＜0.000 1），說明整體模型差異極顯著。一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2對山楂樣液的多酚得率影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC對山楂樣液的多酚得率影響顯著（P＜0.05），BC對其影響不顯著（P＞0.05）。回歸模型的決定系數R2=0.996 3，說明該模型可信度高，失擬項P＞0.05，不顯著。這說明該模型與數據擬合程度較高，試驗誤差小，可用該模型分析和預測山楂多酚閃式提取的結果。

圖5 料液比、提取時間、提取電壓交互作用對山楂果肉多酚得率的影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between material to liquid ratio,extraction time and voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp

由圖5可知，料液比對多酚得率的影響較提取時間大。在一定范圍內，料液比的提高有利于多酚向溶液中轉移；料液比-提取電壓交互作用的傾斜率較小，曲線較緩，兩者的交互作用可以看出料液比比提取電壓對多酚得率的影響更為顯著；提取電壓與提取時間的交互作用對多酚提取率的影響，可以看出提取電壓比提取時間對多酚得率的影響更為顯著。

2.3 驗證試驗

按照選定的條件，結合數學模型得到閃式提取的最佳條件為料液比1∶41（g∶mL）、提取電壓112 V、提取時間79 s，模型預測多酚得率是42.91 mg/g。為驗證該模型的準確性，在該條件下進行山楂多酚提取，重復試驗3次，得到多酚得率均值為42.98 mg/g，此值接近于模型預測值，說明優化的提取工藝是合理的。

3 結論

本試驗以山楂果肉為原料，利用閃式提取法和響應面分析法對多酚提取條件進行了優化，結果表明，最優閃式提取工藝為料液比1∶41（g∶mL）、提取時間79 s、提取電壓112 V，在此條件下，山楂果肉的多酚得率為42.98 mg/g。