心理應激對大鼠牙周炎組織NF-κB表達的影響

鄧道坤 劉 佳 張 旻 陳永進 李 強

牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病，其主要因素是宿主對細菌及其產物的不良反應。然而，單純的菌斑微生物因素目前還難以解釋牙周炎的復雜發病機制。臨床實驗與流行病學研究證實，許多牙周炎患者存在不良心理狀態，心理應激與牙周炎存在密切關聯[1,2]。筆者課題組前期研究也證實了心理應激可以加重大鼠牙周炎、延緩其愈合反應，但具體機制尚不明確[3]。核轉錄因子-κB(NF-κB)是一類參與機體應激反應、炎性反應等生理病理活動的細胞內重要核轉錄因子，并被證明在牙周炎組織中表達明顯升高[4]。心理應激狀態下，需要明確加重的大鼠牙周炎炎癥組織中NF-κB會出現怎樣的變化。因此，本研究通過建立大鼠牙周炎模型和心理應激模型，觀察心理應激作用下NF-κB在牙周組織中的表達變化來探討其對牙周炎的影響。

材料與方法

1.實驗儀器與試劑:4-0 醫用編織絲線(強生醫療器材有限公司)，氟西汀注射液(國藥準字:H12020957，天津金耀氨基酸有限公司)，DYCZ-24DN雙垂直蛋白電泳儀及WD-9413B型凝膠成像系統(北京六一生物科技有限公司)， ELX-800酶標儀(美國BioTek公司)，全蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65以及內參抗體 β-actin(沈陽萬類生物科技有限公司)；RD1412-OF 曠場實驗箱(上海Mobile-datum 公司)；大鼠皮質酮及促腎上腺皮質激素ELISA 試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。

2.實驗動物與分組：40只同源雄性SD大鼠[體重200～220g，第四軍醫大學動物實驗中心，動物實驗許可證號：2015倫審學(048)號]隨機分為5組,即正常對照組(A組)、實驗性牙周炎組(B組)、心理應激組(C組)、實驗性牙周炎+心理應激組(D組)、實驗性牙周炎+心理應激+氟西汀組(E組)。每組8只動物，飼養時間4周。所有動物均于第四軍醫大學口腔醫院實驗動物中心(SPF級)統一飼養，環境溫度22±1℃，相對濕度60%±5%。

3.動物模型建立：參照Zhao等[3]的方法建立大鼠實驗性牙周炎模型，即對大鼠施行10g/L戊巴比妥鈉3.5mg /kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，4-0醫用無菌絲線結扎大鼠右上頜第二磨牙頸部；利用口腔檢查、頜骨大體標本觀察以及組織形態學觀察，驗證大鼠實驗性牙周炎建模的成功有效[3]。參照Cui等[5]的方法應用CUMS法建立動物心理應激模型，即將禁食 12h、禁水 12h、潮濕墊料24h、束縛應激1h、強迫浸水4℃ 5min、強迫浸水45℃ 5min、晝夜顛倒共計 7種應激因子以隨機方式施加于大鼠，每日只施加1種應激因子，1周內每種應激因子施加1次，相同的應激不可連續施加2天。4周后，曠場實驗觀察大鼠行為學變化，ELASA 法測定大鼠血清中皮質醇(CORT)、促腎上腺皮質激素(ACTH)的水平變化，以驗證 CUMS 法建模的有效性。

4.曠場實驗：將大鼠由曠場正中放入，儀器上方的攝像機自動記錄指標，包括大鼠中央區活動時間和大鼠曠場移動總距離。每只大鼠的測試時間為15min。測試完成之后，清除設備內遺留排泄物，75%乙醇擦拭去除上一只大鼠留下的氣味及痕跡后，再進行下一只大鼠的測試。

5.血清學檢測：使用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后通過眼球取血2ml，4℃放置約 1～2h 后 4℃條件下 3000r/min離心30min，吸取上層血清，置于-80℃保存備測。選用ELASA試劑盒檢測大鼠血清CORT和ACTH的含量。

6.NF-κB檢測:取右上側第二磨牙區域牙齦組織，通過Western blot法檢測牙齦組織中IκBα、p-IκBα、p65和p-p65 的蛋白質水平。具體方法：眼科剪剪碎牙齦組織，經 4℃ 預冷，PBS 沖洗，組織裂解液裂解提取齦組織總蛋白，BCA 法定量，配膠，上樣，SDS-PAGE 電泳，轉膜，封閉 1h，加入一抗 4℃孵育過夜，熒光二抗孵育 1h，Bio-Rad 發光儀進行 ECL 法發光檢測。用軟件 Quantity One 對條帶進行灰度掃描并分析。

7.統計學方法：采用SPSS 17.0統計學軟件對所得數據進行One-wayANOVA分析，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.曠場實驗結果:與對照組和單純實驗性牙周炎組動物比較，單純心理應激后大鼠的中央區停留時間明顯延長(P<0.05)，總移動距離明顯縮短(P<0.05)，且與牙周炎+心理應激組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而應用氟西汀后上述指標恢復至正常水平(P>0.05，圖1)。

2.血清學檢測結果：ELISA實驗檢測結果顯示，動物接受心理應激刺激后，兩種典型的應激激素CORT和ACTH的含量顯著升高(P<0.05)，并與牙周炎合并心理應激的動物比較，差異無統計學意義(P>0.05)。而氟西汀可有效逆轉這種升高的趨勢(P>0.05，圖2)。

圖1 曠場實驗結果A.中央區停留時間；B.移動距離。與A組比較，*P<0.05

圖2 血清學檢測結果A.皮質醇；B.促腎上腺皮質激素。與A組比較，*P<0.05

圖3 p-IκBα、IκBα蛋白表達檢測A.p-IκBα、IκBα Western blot法檢測結果；B.p-IκBα相對表達量;C.IκBα相對表達量。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

3.p-IκBα和IκBα蛋白表達檢測：p-IκBα和IκBα的Western blot法檢測和分析結果如圖3所示。與對照組比較，單純心理應激并不引起p-IκBα和IκBα的表達變化(P>0.05)，而牙周炎牙齦組織的p-IκBα蛋白含量上升、IκBα的蛋白含量下降(P<0.05)。當牙周炎動物接受心理應激刺激后，炎性組織的p-IκBα上升幅度以及IκBα下降幅度更加明顯(P<0.05)。經過心理應激拮抗治療后，升高表達的p-IκBα以及降低表達的IκBα趨向正常，但與對照組、單純牙周炎組和單純心理應激組比較差異仍有統計學意義(P<0.05)。

4.NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達檢測：NF-κB p65和p-NF-κB p65的Western blot法檢測和分析結果如圖4所示。與對照組比較，單純牙周炎導致p-NF-κB p65蛋白含量上升(P<0.05)。牙周炎復合心理應激后，牙周炎組織中p-NF-κB p65的高表達更加明顯，并且遠大于單純牙周炎和單純心理應激組(P<0.05)。氟西汀拮抗心理應激后，p-NF-κB p65蛋白表達有所下降，但仍高于對照組、單純牙周炎組和單純心理應激組(P<0.05)。NF-κB p65的蛋白表達在各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

討 論

圖4 NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表達檢測A.p-NF-κB p65、NF-κB p65 Western blot法檢測結果；B.p-NF-κB p65相對表達量;C.NF-κB p65相對表達量。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

牙周炎作為一種常見的慢性炎癥性疾病，特征在于牙齒支持結構的破壞。根據第4次全國口腔流行病學調查，35～44歲居民的牙石檢出率為96.7%，牙齦出血檢出率為87.4%，牙周炎作為牙齒脫落的罪魁禍首，其重要性愈加明顯。牙周組織中的微生物及其產物被認為是牙周炎的始動因素，但是單純菌斑學說尚不足以解釋牙周炎的發病機制。20世紀以來，隨著生物-心理-社會醫學模式的發展，心理因素在牙周炎發生和進展中的重要性得到了越來越廣泛地認可[6]。NF-κB作為細胞內重要核轉錄因子，它涉及機體的調節細胞凋亡、炎性反應、免疫應答、應激反應等，其在牙周炎中的作用日益凸顯。體外研究顯示，牙齦卟啉單胞菌和其他致病性牙周細菌可促進牙周組織中NF-κB的合成，而且牙周病患者牙周組織中存在大量NF-κB激活相關產物(TNF-α、IL-1)[7]。除此之外，研究證明，牙周病的發病機制和易感性可能與NF-κB的激活有關[4]。然而，到目前為止，NF-κB作為重要的炎性反應因子，其在心理應激加重牙周炎發展過程中扮演的角色尚未明晰[8]。

本研究通過7種應激因子隨機施加于大鼠建立心理應激模型，建立慢性不可預知性心理應激動物模型，該模型已在國際上被廣泛應用，并被認為可有效避免大鼠對重復應激產生的耐受性以及對實驗結果的影響[6]。本課題組前期研究已顯示，心理應激加重牙周組織破壞、延緩了牙周炎的愈合進程[3]。經過分析顯示，本研究中接受心理應激的動物，其自發性活動較對照組和實驗性牙周炎組明顯下降。并且，應激激素水平明顯高于對照組和單純牙周炎組，與之前的研究結果相似[1]。在進行有效的藥物治療后，大鼠上述變化指標恢復至對照水平，這說明本研究心理應激模型建立成功。

NF-κB 是一類普遍存在的重要的轉錄調節因子，由Rel蛋白家族成員中的兩種組成同源或異源二聚體，如p65-p65或p65-p50。在多數細胞中，NF-κB與抑制蛋白 IκB 結合形成三聚體，一般情況下沒有活性。IκB 抑制蛋白家族能掩蓋 NF-κB 的核定位信(NLS)，抑制 NF-κB 核易位。當細胞受到外界刺激時，TRAF/RIP與 TAK1 或者 TRAFs 和NIK 結合啟動 NF-κB 經典及非經典通路，使 Iκκ 活化。當 Iκκ 活化后，IκB 蛋白被磷酸化，最終降解，從而釋放了 NF-κB二聚體；游離的 NF-κB 二聚體通過各種轉錄后被激活，并進入細胞核，與胞核內特異的DNA鏈結合，進而加快目的基因的轉錄。在眾多研究中， IκB、p-IκB、p-NF-κB p65的含量變化等都被作為NF-κB信號通路激活的標志[9]。

NF-κB和各種疾病的密切關系受到研究者的廣泛關注，包括炎癥、免疫性疾病、癌癥等[10,11]。有病例對照研究將45例男性按年齡分為應激組與對照組，測得應激組中壓力誘導外周血NF-κB與DNA結合活性顯著增高[12]。而在動物實驗中，褪黑素可通過抑制p65的核轉位來減少心理應激誘導的NF-κB表達來改善細胞凋亡，表明心理應激與NF-κB存在密切關聯[13]。Ambili等[4]通過免疫組化和PCR技術測量患病和健康牙齦組織細胞中NF-κB表達及其轉錄因子，發現患病組織明顯高于健康組織。牙周炎發展到后期，常表現為大量牙槽骨吸收，而NF-κB信號通路與骨吸收的關系已經非常明確——即NF-κB與破骨細胞形成和骨吸收活性增加呈正相關[14]。上述研究提示，NF-κB在心理應激誘導牙周炎過程中可能起到了一定的作用。

本研究結果顯示，在牙周炎模型的基礎上施加心理應激，會進一步促使p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白水平的上升以及IκBα蛋白水平的下降，而NF-κB p65蛋白含量不變，提示心理應激促進了IκBα和NF-κB p65的磷酸化，最終的結果是NF-κB通路被激活。而在氟西汀治療后，p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達量下降、IκBα蛋白表達量上升，NF-κB p65總量無明顯變化，說明NF-κB通路被抑制。這與之前研究者對牙周炎研究中涉及到的NF-κB測量結果類似[15]。這些發現表明，NF-κB信號通路的激活參與中心理應激加速牙周炎的發生、發展，心理應激治療通過糾正牙周局部NF-κB過度激活，能夠在很大程度上減少對牙周組織的損傷。然而，藥物治療組p-IκBα和p-NF-κB p65的蛋白表達仍高于單純牙周炎組，IκBα表達仍低于單純牙周炎組，說明心理應激拮抗治療并未完全逆轉心理應激造成的牙周炎齦組織中NF-κB過度激活。這提示牙周炎是一個復雜的病理生理過程，心理應激因素去除后，牙周炎局部環境可能還存在著其他影響NF-κB過表達的因素。比如，ROS也可以激活牙周炎中的NF-κB信號，從而導致促炎細胞因子和趨化因子的表達，最終觸發炎性反應和破骨細胞分化，導致牙周破壞[16]。此外，動物實驗也證實，慢性應激可通過抑制糖皮質激素受體-α信號，介導NF-κB活性上調，最終表現為牙槽骨喪失，牙周帶深度增加[17]。

綜上所述，筆者推測NF-κB信號通路是心理應激加重牙周炎的重要機制之一，心理應激可以誘導NF-κB的過表達，從而導致牙周炎的加重。在未來的研究中，筆者將繼續深入探討NF-κB是如何通過調節上、下游分子來介導心理應激加重牙周炎病變，從而為研究牙周炎的心理病因學發病機制及有效防治提供新的防治策略。