BTN3A3低表達促進肝細胞癌的惡性進展

張夢夢 蘇曉東 田毅夫 季佳宇 劉福生

2018年，世界范圍內(nèi)肝癌的發(fā)生率在所有腫瘤類型中居第6位，病死率排名第4位，嚴重威脅人類健康。僅2018年，全球共有841000例新發(fā)肝癌患者，同時782000例患者死亡[1]。原發(fā)性肝癌包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma)，以及其他發(fā)生率低的類型。其中肝細胞癌的發(fā)生率約占原發(fā)性肝癌(liver cancers)的80%[2]。

在疾病早期確診的HCC患者可以進行手術(shù)切除術(shù)或局部消融治療，然而，高級別的HCC患者通常只能進行療效有限的、以減輕癥狀為目的的保守治療。目前，已被批準用于高級別HCC系統(tǒng)治療的臨床藥物，僅有多重激酶抑制劑索拉菲尼(sorafenib)，臨床試驗數(shù)據(jù)表明，索拉菲尼可延長高級別HCC患者中位生存期約3個月，同時化療不良反應(yīng)強[3]。因此，找尋新的分子靶點是HCC臨床研究的重要工作。

嗜乳脂蛋白家族成員含有1～2個細胞外Ig結(jié)構(gòu)域，由于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與B7家族共受體蛋白質(zhì)具有部分相似性，因此被稱為B7相關(guān)蛋白質(zhì)[4～6]。BTN3A亞家族包含3個成員，BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3，該亞家族成員被證實在多種腫瘤細胞中表達[7, 8]。近期報道，BTN3A3及BTN3A2中特定的單核苷酸多態(tài)性分別增加卵巢癌及胃癌的發(fā)生概率[9, 10]。BTN3A3的表達情況可預(yù)測胃癌患者對氟尿嘧啶(fluorouracil)化療藥物的敏感度[11]。乳腺癌腫瘤微環(huán)境中，位于腫瘤相關(guān)巨噬細胞膜表面的LSECtin通過與乳腺腫瘤干細胞表面的BTN3A3受體結(jié)合，促進腫瘤細胞的干性[12]。對于BTN3A家族蛋白，其在肝癌中的作用目前未見報道。

本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因的表達量降低，同時，低表達BTN3A3基因的肝癌患者整體生存期顯著縮短。這提示，BTN3A3可能對肝癌的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。肝癌細胞系體外遷移實驗表明，降低BTN3A3表達后促進肝癌細胞系的遷移，侵襲實驗表明，降低BTN3A3表達后促進肝癌細胞系的侵襲，說明BTN3A3調(diào)控肝癌細胞系的擴散轉(zhuǎn)移能力。降低BTN3A3表達后肝癌細胞系克隆形成能力增強，說明BTN3A3調(diào)控單個肝癌細胞在新的位點增殖的能力。本研究初步明確了減少BTN3A3的表達能夠促進肝細胞癌的惡性進展，有助于增加對BTN3A亞家族蛋白質(zhì)功能的了解，為發(fā)展新的高級別肝細胞癌的分子治療靶點提供線索。

材料與方法

1.細胞培養(yǎng)及試劑：HLE細胞系購自ATCC，HepG2細胞系購自協(xié)和細胞資源中心。HLE及HepG2細胞系采用DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司, C11995500BT)培養(yǎng),補充10%胎牛血清(杭州四季青公司, 11011-8611)和1%雙抗(美國Gibco公司, 15140-122)。

2.抗體：BTN3A3抗體購自Proteintech公司(15896-1-AP)，β-actin抗體購自美國Sigma公司(A5441)。

3.SiRNA轉(zhuǎn)染：SiRNA(1#-GCUCGUGGAGAG-AAGUCUUTT，2#-GCCUGACUGAUGGGAAUAATT)由蘇州吉瑪公司合成，用以敲減肝癌細胞系中BTN3A3的表達。采用Lipo3000細胞轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Life technology公司, L3000-015)進行轉(zhuǎn)染操作。細胞轉(zhuǎn)染48h后，進行后續(xù)相應(yīng)實驗操作。

4.細胞遷移分析：于200μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，加入1×105個細胞；將細胞懸液置于細胞培養(yǎng)小室(美國Millipore公司, MCEP24H48)的上室中；下室加入800μl含有10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)24h后，獲取細胞培養(yǎng)小室進行結(jié)晶紫染色(中國Beyotime公司, C0121)并拍照。該實驗重復(fù)3次。

5.細胞侵襲分析：細胞培養(yǎng)小室采用Matrigel (美國BD公司, 356234)預(yù)包被，置于37℃孵箱中3h形成Matrigel包被層。于200μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，加入2×105個細胞；將細胞懸液置于細胞培養(yǎng)小室的上室中；下室加入800μl含有20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)24h后，獲取細胞培養(yǎng)小室進行結(jié)晶紫染色并拍照。該實驗重復(fù)3次。

6.細胞克隆形成分析：包含1×103個細胞的2ml細胞懸液接種于6孔板的孔中，培養(yǎng)2周后，進行結(jié)晶紫染色并統(tǒng)計克隆數(shù)。每個實驗組設(shè)置3個復(fù)孔，該實驗重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.BTN3A3基因的表達量：采用TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的數(shù)據(jù)，分析了BTN3A3基因在不同分期患者中的表達情況。Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因表達量顯著下降(圖1)，其中Ⅱ期患者的表達量顯著高于Ⅳ期患者(P<0.01)，Ⅲ期患者的表達量顯著高于Ⅳ期患者(P<0.05)。Ⅰ期肝癌患者中BTN3A3表達量同Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者之間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，Ⅱ期肝癌患者中BTN3A3表達量同Ⅲ期患者之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 Ⅳ期肝細胞癌患者腫瘤組織中BTN3A3表達量顯著下降*P<0.05,**P<0.01

2.低表達BTN3A3基因的肝癌患者整體生存期：采用TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的數(shù)據(jù)，分析了BTN3A3基因的表達量與患者整體生存期之間的關(guān)系。獲取364例肝癌患者的生存期數(shù)據(jù)，并根據(jù)BTN3A3基因表達量的高低分為兩組，高表達組182例患者，低表達組182例患者，進行整體生存期的統(tǒng)計分析(圖2)。低表達BTN3A3基因的患者整體生存期顯著縮短(P<0.05)。

圖2 低表達BTN3A3的肝癌患者整體生存期顯著縮短

3.采用SiRNA成功敲減肝癌細胞系HLE及HepG2中BTN3A3的表達：采用SiRNA：1#-GCUCGUGGAGAGAAGUCUUTT，2#-GCCUGACUGAU-GGGAAUAATT，轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HLE及HepG2。收集轉(zhuǎn)染后的細胞，提取總蛋白質(zhì)進行Western blot法分析(圖3)。兩株細胞系中的BTN3A3表達量在兩個靶點的作用下均顯著下降。

圖3 在HLE、HepG2細胞系中成功敲減BTN3A3的表達A.HLE細胞系轉(zhuǎn)染SiRNA后進行Western blot法結(jié)果圖; B.HepG2細胞系轉(zhuǎn)染SiRNA后進行Western blot法結(jié)果圖

4.降低BTN3A3表達后促進肝癌細胞系的遷移：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細胞系，轉(zhuǎn)染48h后進行細胞遷移實驗。降低BTN3A3表達后，兩株肝癌細胞系的遷移能力均顯著增強(圖4)。

圖4 HLE、HepG2細胞系中降低BTN3A3表達后細胞的遷移能力顯著增強A.HLE細胞系遷移實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); B.HLE細胞系遷移實驗統(tǒng)計結(jié)果; C.HepG2細胞系遷移實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); D.HepG2細胞系遷移實驗統(tǒng)計結(jié)果;*P<0.05, **P<0.01,***P=0.000

5.降低BTN3A3表達后促進肝癌細胞系的侵襲：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細胞系，轉(zhuǎn)染48h后進行細胞遷移實驗。降低BTN3A3表達后，兩株肝癌細胞系的侵襲能力均顯著增強(圖5)。

圖5 HLE、HepG2細胞系中降低BTN3A3表達后細胞的侵襲能力顯著增強A.HLE細胞系侵襲實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); B.HLE細胞系侵襲實驗統(tǒng)計結(jié)果; C.HepG2細胞系侵襲實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫，×50); D.HepG2細胞系侵襲實驗統(tǒng)計結(jié)果;*P<0.01,**P=0.000

6.降低BTN3A3表達后肝癌細胞系克隆形成能力：采用BTN3A3-SiRNA轉(zhuǎn)染HLE及HepG2肝癌細胞系，轉(zhuǎn)染48h后進行細胞克隆形成實驗。降低BTN3A3表達后，兩株肝癌細胞系的克隆形成數(shù)目顯著增加(圖6)。

圖6 HLE、HepG2細胞系中降低BTN3A3表達后細胞的克隆形成能力顯著增強A.HLE細胞系克隆形成實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫); B. HLE細胞系克隆形成實驗統(tǒng)計結(jié)果; C.HepG2細胞系克隆形成實驗結(jié)果圖(結(jié)晶紫); D.HepG2細胞系克隆形成實驗統(tǒng)計結(jié)果;*P<0.05，**P=0.000

討 論

轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了90%癌癥患者的死亡[13]。通過切除術(shù)或經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)，可成功治療肝細胞癌患者的原發(fā)腫瘤，然而由于局部侵襲及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，患者復(fù)發(fā)概率高。明確肝細胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制，有利于發(fā)展有效的針對高級別肝細胞癌的治療靶點。本研究通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌患者的臨床數(shù)據(jù)進行分析，明確了Ⅳ期患者中BTN3A3基因表達量顯著降低；同時低表達BTN3A3的患者，生存期顯著縮短。設(shè)計并獲得敲減BTN3A3表達的SiRNA序列，并在肝癌細胞系HLE及HepG2中驗證有效。進而證實在兩株肝癌細胞系中，敲減BTN3A3的表達后，細胞遷移、侵襲能力顯著增強，同時克隆形成能力顯著增強。初步證實了BTN3A3在肝癌惡性進展中的抑制作用。

根據(jù)AJCC對于肝癌的分期定義，Ⅳ期患者發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠處轉(zhuǎn)移。在該分期的患者中，BTN3A3基因的表達量顯著降低。由此推斷，BTN3A3可能存在抑制肝癌轉(zhuǎn)移的功能，低表達該基因的患者，對腫瘤侵襲的抑制作用降低，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移。本研究所獲取的ATCC數(shù)據(jù)庫中的患者數(shù)據(jù)，Ⅳ期患者為6例，數(shù)目較少，因此還有待增加病例數(shù)后進一步驗證。

針對364例肝癌患者的生存期數(shù)據(jù)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)低表達BTN3A3基因的患者整體生存期顯著縮短。這說明低表達該基因，不利于肝癌患者的疾病控制，BTN3A3具有在肝癌惡性進展中的抑制作用。同時，肝癌患者生存期分析的結(jié)果，也支持前述Ⅳ期肝癌患者中BTN3A3基因表達量顯著下降的結(jié)論。

在轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中，一個位于原發(fā)腫瘤灶的癌細胞有序地發(fā)生下列變化，原位侵入周圍組織，進入淋巴系統(tǒng)及血液系統(tǒng)的微管，存活，通過血液系統(tǒng)到達遠處組織的微血管中，穿出血管，在遠處組織微環(huán)境中存活，適應(yīng)新的環(huán)境，增殖并形成新的轉(zhuǎn)移灶[14]。采用Transwell細胞培養(yǎng)小室驗證敲減BTN3A3后肝癌細胞系的遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示，敲減BTN3A3表達后，細胞的遷移及侵襲能力顯著增強。遷移分析體現(xiàn)了肝癌細胞系在敲減BTN3A3表達后，在淋巴系統(tǒng)及血液系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移能力增強，而侵襲分析體現(xiàn)了肝癌細胞系侵入周圍組織能力增強。這都有利于肝癌細胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

克隆形成實驗初步體現(xiàn)了單個腫瘤細胞在到達新的組織微環(huán)境中存活和定殖的能力。敲減BTN3A3基因表達后，肝癌細胞系的克隆形成能力顯著增強，這提示該基因的表達降低有利于轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生。

當前，關(guān)于BTN3A3在腫瘤中的具體調(diào)控機制鮮有報道。在胃癌中，Pan等[11]采用生物信息及統(tǒng)計學(xué)方法，明確了BTN3A3對化療藥物氟尿嘧啶有效性的預(yù)測作用。在卵巢癌中，Peedicayil等[10]采用統(tǒng)計學(xué)方法，證實BTN3A3的SNPs與卵巢癌的發(fā)生率呈負相關(guān)。然而兩項研究均未進行分子機制的研究。在乳腺癌中，位于巨噬細胞膜表面的LSECtin蛋白與位于乳腺癌細胞膜表面的BTN3A3結(jié)合，通過促進JAK2/STAT3信號通路活性，增強乳腺癌細胞的干性[12]。這一研究結(jié)果提示，在肝癌中BTN3A3可能也發(fā)揮對腫瘤細胞干性的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)移發(fā)生前期，腫瘤細胞通過表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作用，增加自身可塑性及干性，以利于轉(zhuǎn)移的進行。筆者推斷，肝癌細胞中BTN3A3基因極有可能在EMT過程中發(fā)揮調(diào)控作用。在后續(xù)的深入研究BTN3A3抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制中，筆者將以此為切入點。

綜上所述，本研究證實BTN3A3基因在Ⅳ期肝癌患者中表達量顯著下降，低表達該基因的患者整體生存期顯著縮短。在細胞水平明確了敲減BTN3A3表達后，肝癌細胞系HLE及HepG2的細胞遷移、侵襲及克隆形成能力均顯著增強，初步證實了BTN3A3在肝癌惡性進展中的抑制作用。這將為后續(xù)深入研究BTN3A3抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供支持，同時為探索新的有效的針對高級別肝細胞癌的治療靶點提供線索。