番茄褪綠病毒侵染黃瓜的首次報(bào)道

王天旗 史曉斌 鄭立敏

摘要 番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）是嚴(yán)重危害世界經(jīng)濟(jì)作物的一種病毒，寄主范圍廣泛。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)黃瓜Cucumis sativus表現(xiàn)出葉片黃化、脈間褪綠的疑似番茄褪綠病毒感病癥狀，同時(shí)葉片背面聚集了大量煙粉虱。采用RT-PCR方法對(duì)樣品葉片和煙粉虱進(jìn)行檢測(cè)，ToCV感染率為65%，且發(fā)病葉片上煙粉虱攜帶ToCV。為進(jìn)一步確定黃瓜是否為番茄褪綠病毒的新寄主，室內(nèi)利用農(nóng)桿菌侵染性克隆接種健康黃瓜，結(jié)果顯示：接種30 d的黃瓜新生葉片出現(xiàn)褪綠癥狀。采用ToCV HSP70基因的引物對(duì)田間黃瓜葉片、煙粉虱和室內(nèi)黃瓜新生葉片進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出約450 bp的條帶，在NCBI上BLAST顯示與KC887999.1的同源性最高，為99%。這些數(shù)據(jù)表明黃瓜是番茄褪綠病毒的寄主。這是ToCV感染黃瓜的首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 番茄褪綠病毒; 黃瓜; 煙粉虱; RT-PCR

中圖分類號(hào)： S 436.421 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019100

Abstract Tomato chlorosis virus （ToCV） causes severe damage to crops worldwide， and it infects a wide range of plant hosts. In a field investigation， we found leaf etiolation， interveinal chlorosis of suspected symptoms of tomato chlorosis virus disease in cucumber （Cucumis sativus）; meanwhile a large number of Bemisia tabaci gathered on the back of cucumber leaves. The leaves and B.tabaci were tested by RT-PCR. The results showed that the ToCV infection rate was 65%， and B.tabaci on the infected leaves carried ToCV. In order to further determine whether cucumber is the new host of tomato chlorosis virus， healthy cucumbers were inoculated with agrobacterium-infected clones indoors. The results showed that chlorosis appeared in new leaves of cucumbers 30 days after inoculation. The primers of ToCV HSP70 gene were used to perform RT-PCR on cucumber leaves， whiteflies and new leaves of indoor cucumber， and a band of 450 bp was amplified. BLAST on NCBI showed the highest homology （99%） with KC887999.1. These data indicate that cucumber is the host of tomato chlorosis virus. This is the first report of ToCV infection in cucumbers.

Key words Tomato chlorosis virus; Cucumis sativus; Bemisia tabaci; RT-PCR

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）屬于長線形病毒科Closteroviridae，毛形病毒屬Crinivirus，于1998年在美國佛羅里達(dá)州的溫室番茄中首次報(bào)道[1]。自2004年首次在中國臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)以來，已在北京、山東、天津、海南、湖南和云南等多個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)并迅速蔓延，對(duì)番茄等蔬菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失[2-7]。該病毒只能通過韌皮部侵染的方式，由媒介昆蟲以半持久方式傳播，其中以煙粉虱Bemisia tabaci的傳播能力最為高效。感染ToCV的植物一般是從中下部葉片出現(xiàn)癥狀并逐漸向上發(fā)展，中部葉片表現(xiàn)為葉脈間輕微褪綠黃化，底部葉片則出現(xiàn)明顯的葉片褪綠黃化，葉脈深綠，感病葉片變脆且易折，葉片黃化疑似營養(yǎng)缺素癥[8]。ToCV可侵染茄科、十字花科、夾竹桃科、藜科和菊科等多科植物[9-11]。

黃瓜Cucumis sativus是我國重要的保護(hù)地栽培蔬菜之一。中國各地普遍栽培，且許多地區(qū)均有溫室或塑料大棚栽培，廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū)。感染黃瓜的病毒主要有西瓜花葉病毒（WMV）、番木瓜環(huán)斑病毒（PRSV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜綠斑花葉病毒（CGMMV）和瓜類褪綠黃化病毒（CCYV）[12-14]。目前尚未有關(guān)于番茄褪綠病毒侵染黃瓜的報(bào)道。

2017年9月在湖南省蔬菜研究所基地發(fā)現(xiàn)黃瓜表現(xiàn)疑似ToCV感染癥狀，同時(shí)在葉背面發(fā)現(xiàn)大量煙粉虱。采集癥狀明顯的黃瓜葉片及煙粉虱并通過ToCV特異性引物進(jìn)行鑒定，隨后利用農(nóng)桿菌侵染性克隆接種健康黃瓜進(jìn)一步驗(yàn)證黃瓜能否感病，以期明確黃瓜的受害情況，為預(yù)防和控制流行病毒病提供預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年9月，在湖南長沙蔬菜研究所基地發(fā)現(xiàn)大量黃瓜葉片褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色。隨機(jī)采集葉片60份，其中顯癥樣品50份、無癥狀樣品10份，保存于-80℃冰箱備用。同時(shí)，收集帶有煙粉虱的顯癥黃瓜葉片，煙粉虱放入離心管，葉片放入保鮮袋后帶回實(shí)驗(yàn)室，并在顯微鏡下觀察煙粉虱形態(tài)特征并區(qū)分雌雄。隨后從采集的煙粉虱中隨機(jī)選取12頭，進(jìn)行多頭煙粉虱的RNA提取，重復(fù)3次，以明確煙粉虱樣本是否攜帶ToCV[15]。并隨機(jī)各選取雌雄性煙粉虱20頭，分別鑒定煙粉虱的帶毒率。采用以ToCV HSP70基因設(shè)計(jì)的特異性引物ToCV-3（表1）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 樣品RNA提取、cDNA的合成及RT-PCR擴(kuò)増

1.2.1 植物和煙粉虱總RNA的提取

田間黃瓜RNA的提取采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取試劑盒，步驟依照試劑盒說明書操作。煙粉虱RNA的提取采用TRIzol法并稍作修改。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

體系步驟參照Vazyme生物公司HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）產(chǎn)品說明書進(jìn)行。以提取的總RNA為模板，Random hexamers為引物合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

采用ToCV HSP70基因特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：ddH2O 8 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R 0.5 μL（10 μmol/L），ToCV-3F 0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 模板1 μL。PCR程序?yàn)椋?5℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，產(chǎn)物純化回收并連接于克隆載體pGEM-T easy （Promega， USA），熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。利用BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

1.3 煙粉虱生物型鑒定

煙粉虱單頭DNA的提取：取3 μL蛋白酶K于封口膜上，單頭煙粉虱置于其中，研磨成勻漿后移至加入20 μL 10 mg/mL的樹脂溶液PCR 管中混勻，37℃孵育1 h，96℃ 10 min。

以WT-F和WT-R為引物[16]，對(duì)提取的煙粉虱DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20 μL：ddH2O 7 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，WT-F 1 μL，WT-R 1 μL（表1），模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

酶切體系：ddH2O 7.5 μL，AseⅠ0.5 μL，緩沖液3.1X buffer 2 μL，加入10 μL PCR產(chǎn)物混勻后置于37℃孵育2～3 h。酶切后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。每次取20頭煙粉虱檢測(cè)，重復(fù)3次。

1.4 煙粉虱帶毒情況的檢測(cè)

從田間黃瓜上采集的煙粉虱中隨機(jī)選取12頭，進(jìn)行多頭煙粉虱的RNA提取，采用ToCV HSP70基因特異性引物 ToCV-3（表1）進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，以明確煙粉虱樣本是否攜帶ToCV。田間黃瓜上煙粉虱中隨機(jī)選取20頭，進(jìn)行單頭煙粉虱的RNA提取，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)雌雄煙粉虱的帶毒率。

1.5 供試植物和接種病毒

供試植物：黃瓜（品種為‘長春密刺）種植在26℃±2℃，相對(duì)濕度75%±5%、光照周期 L∥D=16 h∥8 h的溫室防蟲籠中。為了確定ToCV能否系統(tǒng)感染黃瓜，將0.5 mL農(nóng)桿菌侵染性cDNA克隆注射到三葉期的植物中[15]。共接種20株黃瓜，并以注射接種液作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間樣品癥狀

疑似感染ToCV的黃瓜主要表現(xiàn)為：葉片褪綠變黃，并隨著癥狀的發(fā)展除了葉脈仍保持綠色外，幾乎整個(gè)葉片全變黃色，葉片變脆且易折，同時(shí)還伴隨部分葉片邊緣卷曲等典型的ToCV癥狀（圖1 a～c）。這與山東地區(qū)報(bào)道的ToCV引起的番茄病害特征類似[17]。基于病害特征和煙粉虱的發(fā)生，初步推測(cè)此次發(fā)現(xiàn)的黃瓜病害是由ToCV引起的病毒病。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

利用ToCV HSP70基因特異性引物對(duì)采集的黃瓜樣本進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè) （圖2），60份樣品中有39份樣品被鑒定為ToCV陽性，包括37份顯癥樣品和2份未顯癥樣品，檢出率為65%。產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，顯示擴(kuò)增出大約450 bp的清晰條帶，而健康黃瓜葉片陰性對(duì)照未檢測(cè)到條帶。

將PCR產(chǎn)物純化回收后，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，每個(gè)樣本取3個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為439 bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與KC887999.1的同源性最高，為99%。說明感染黃瓜的病毒為ToCV。

2.3 煙粉虱生物型鑒定

對(duì)田間黃瓜葉背面采集的煙粉虱進(jìn)行生物型鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)AseⅠ酶切后分別得到500 bp和100 bp的兩條帶（圖3），結(jié)果顯示田間煙粉虱均為MED （Q）煙粉虱。

2.4 煙粉虱帶毒情況的檢測(cè)

收集田間黃瓜葉背面的煙粉虱，每株黃瓜葉片隨機(jī)選取12頭進(jìn)行多頭煙粉虱的RNA提取，重復(fù)3次，進(jìn)行ToCV的RT-PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增得到大小為450 bp左右的特異性條帶，與目標(biāo)片段大小一致（圖4）。此外，田間感病黃瓜上雌雄性煙粉虱隨機(jī)各選取20頭，采用ToCV HSP70基因特異性引物ToCV-3（表1）進(jìn)行單頭煙粉虱的ToCV檢測(cè)，重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)得到雌性和雄性煙粉虱的平均帶毒率分別為83.5%和 61.5%，雌性感染率高于雄性（表2）。

2.5 室內(nèi)接種ToCV感染黃瓜

與室內(nèi)健康黃瓜相比，接種30 d后黃瓜表現(xiàn)出葉片黃化、脈間開始褪綠及葉邊緣卷曲等番茄褪綠病毒感病癥狀（圖1d）。對(duì)室內(nèi)接種30 d后的黃瓜進(jìn)行RT-PCR鑒定（圖5），接種的20株黃瓜中有11株被鑒定為ToCV陽性，染毒率為55%。將PCR產(chǎn)物純化回收后，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，每個(gè)樣本取3個(gè)克隆送公司進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果為439 bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與KC887999.1的同源性為99%。初步驗(yàn)證了ToCV對(duì)黃瓜的侵染性。

3 討論

本研究在湖南省蔬菜研究所基地黃瓜種植區(qū)采集葉片，利用 RT-PCR 方法檢測(cè)疑似發(fā)病葉片，經(jīng)序列分析比對(duì)，確認(rèn)ToCV侵染黃瓜，這是ToCV侵染黃瓜的首次發(fā)現(xiàn)。自然條件下，多種植物病毒的復(fù)合侵染在田間作物上常有發(fā)生，很多重要的病毒病害也是多種病毒相互作用共同侵染導(dǎo)致的[18]。這些田間采集的黃瓜樣品中，不排除其他病毒病原的存在，這也是導(dǎo)致室內(nèi)接種ToCV的癥狀與田間癥狀有所出入的主要原因。此外，田間發(fā)病植株的帶毒量較高，而室內(nèi)接毒的病毒量較低，這也是造成室內(nèi)接種與田間癥狀不符的原因。

在ToCV陽性的37份樣品中，有2份無明顯癥狀，表明黃瓜顯癥可能與ToCV的積累量或者濃度有關(guān)，或存在部分潛隱性侵染。ToCV在湖南黃瓜樣品的檢出率高達(dá)65%，這一較高的發(fā)病率，一方面對(duì)于黃瓜種植存在威脅;另一方面由于ToCV可以通過煙粉虱傳播，對(duì)其他經(jīng)濟(jì)作物造成潛在威脅。這與先前的報(bào)道一致[19-20]。因此，對(duì)煙粉虱的監(jiān)測(cè)有利于預(yù)防和控制該病毒的發(fā)生，減少其帶來的危害。

番茄褪綠病毒具有多種寄主，除感染番茄、辣椒、馬鈴薯和其他茄科植物外，還可感染13屬30種植物[2，21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)的新寄主黃瓜，在農(nóng)業(yè)上設(shè)施栽培面積較大，番茄褪綠病毒病一旦暴發(fā)，將導(dǎo)致黃瓜品質(zhì)變差、產(chǎn)量下降，造成的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重影響農(nóng)戶的種植積極性。此外，在室內(nèi)對(duì)黃瓜接毒的過程中發(fā)現(xiàn)，在病毒侵染后，黃瓜表現(xiàn)癥狀較晚，而在表現(xiàn)癥狀之前已經(jīng)能夠檢測(cè)到病毒，這提醒我們?cè)谔镩g黃瓜可以保存番茄褪綠病毒的毒源，不容易被發(fā)現(xiàn)，且更容易造成番茄褪綠病毒在其他寄主上的擴(kuò)散，應(yīng)該重視在黃瓜上對(duì)番茄褪綠病毒病的提前檢測(cè)。生產(chǎn)上對(duì)番茄褪綠病毒的防治應(yīng)采取聯(lián)防聯(lián)控、綜合防治。田間考察發(fā)現(xiàn)病毒病對(duì)黃瓜栽培品種的危害很嚴(yán)重，但目前尚未有根治病毒病的有效方法，病毒病的防治主要還是以預(yù)防為主。因此，本研究對(duì)于ToCV的預(yù)防和防治具有重要意義。

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（責(zé)任編輯： 田 喆）