解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2對大白菜軟腐病防治效果研究

崔文艷 何朋杰 楊麗娟

摘要 為了明確解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2（Y2）對大白菜軟腐病的防治效果，本研究通過平板對峙和離體生防試驗評估了B9601-Y2對軟腐病的生防潛力，同時采用綠色熒光蛋白標記菌株Y2-gfp，測定其在大白菜植株內的定殖能力，在溫室內研究了B9601-Y2對大白菜軟腐病的防治和增產效果。結果表明，B9601-Y2在LB平板和離體植物組織上均能有效地抑制軟腐病原菌的生長;淋灌Y2-gfp發酵液后，標記菌在大白菜根際、根、莖、葉等組織內的種群數量呈現出“先上升后下降最后趨于平穩”的趨勢，最終穩定在約103cfu/g組織;溫室防效試驗結果表明，移栽生防苗后淋灌Y2菌懸液防治效果最佳，為62.23%，僅移栽生防苗與移栽普通苗后淋灌Y2菌懸液防效分別為28.87%與49.48%，大白菜產量分別增加了146.58%、47.52%及109.37%。研究結果表明解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2能夠有效防控大白菜軟腐病。

關鍵詞 軟腐病; 解淀粉芽胞桿菌B9601-Y2; 土傳病害; 漂浮育苗; 生物防治

中圖分類號： S 476 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019038

Abstract To determine the control effect of Bacillus amyloliquefaciens B9601-Y2 （Y2） against Chinese cabbage soft rot caused by Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum （Pcc）， it was evaluated by the plate confrontation and biocontrol activity tests in vitro. Its colonization ability was tested in Chinese cabbage by drenching Y2-gfp suspension， a gfp-labeled Y2 strain， and soft rot control and yield recovery effects were also studied in the greenhouse. The results indicated that the growth of Pcc on LB agar plate and in plant tissue in vitro was effectively inhibited by Y2. Y2 population in the rhizosphere， root， stem and leaf of cabbage after drenching showed a trend of rising first， decreasing and then leveling off; finally the colonization density kept at 103cfu/g tissues. Moreover， the control effect of Y2 suspension drenching on Y2-cultured seedlings was 62.23%， while the control effect on Y2-cultured seedlings without Y2 suspension drenching was 28.87% and the control effect of Y2 suspension drenching on the seedlings without Y2-substrate was 49.48%. Meanwhile， the three treatments increased the fresh weight of cabbage by 146.58%， 47.52% and 109.37%， respectively. This study suggested that Y2 could efficiently control soft rot of Chinese cabbage.

Key words soft rot; Bacillus amyloliquefaciens B9601-Y2; soil-borne disease; float-seedling; biological control

由果膠桿菌Pectobacterium spp.引起的細菌性軟腐病是大白菜的三大主要病害之一，一般發生在大白菜結球的中后期，造成極大損失[1]。與病毒病和霜霉病相比，軟腐病在大白菜的種植、運輸、儲藏及銷售過程中均會發生[3]。近年來，國內軟腐病發病面積急劇增加，嚴重危害大白菜等重要蔬菜作物的生產。果膠桿菌可隨灌溉用水、大白菜的運輸與貯藏及人類活動而傳播，且對自然環境適應性強，是自然條件下地理分布與寄主范圍最為廣泛的植物病原菌之一[4]。在田間一旦發現明顯的軟腐癥狀后再采取防治措施往往很難取得理想的防治效果。培育抗病品種是防治病害的最好選擇，但是我國主栽大白菜品種對軟腐病的抗性不理想;化學防治雖然有效但由于其對環境和農產品安全具有負面影響而難以成為首選;生物防治一般說來較為安全，已成為經濟和有效的防控手段之一。

芽胞桿菌是最重要的植物病害生防資源菌之一，以其高效性和安全性而著稱，能夠拮抗常見的主要植物病原菌[5-6]。解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens B9601-Y2（下稱Y2）分離自小麥根際土壤，對多種植物病害有良好的生防效果，應用潛力巨大[7-8]，但是否能夠防控大白菜軟腐病仍不清楚。本文就室內拮抗、離體生防活性測試、植株內的定殖及溫室防效等進行了初步研究，以期為大白菜軟腐病的生物防治及Y2在農業生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：解淀粉芽胞桿菌Y2及其綠色熒光蛋白（GFP）標記菌株Y2-gfp （下稱Y2-gfp）均系本實驗室自有知識產權保存菌株（-80℃保存）。大白菜軟腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum （Pcc），編號E1（下稱E1），由本實驗室分離鑒定保存。

供試品種與樣品：‘青島83-1是高感軟腐病的大白菜品種，種子購自昆明市安寧市青龍鎮農貿市場。健康的大白菜植株、黃瓜及馬鈴薯均購自昆明市龍頭街農貿市場。商業育苗基質由微生物菌種篩選與應用國家地方聯合工程研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 E1與Y2菌懸液的制備

分別挑取E1和Y2單菌落于LB液體培養基中，37℃、160 r/min的條件下振蕩培養48 h，使用涂板梯度稀釋法檢測菌落數量后使用PBS緩沖液（pH 7.0）重懸備用。

1.2.2 室內平板拮抗試驗

吸取200 μL 1×106cfu/mL的E1菌懸液至不同LB固體平板，使用涂布器輕輕涂布均勻，再使用移液槍吸取10 μL Y2 菌懸液（1×107cfu/mL）點滴到平板中央。以滴加等量PBS緩沖液作為陰性對照。每個處理3次重復。28℃恒溫培養24 h后測定Y2菌落與抑菌圈的半徑[1]。

1.2.3 室內離體試驗

參考Garge等[9]的方法開展離體試驗，略有修改。將健康的大白菜葉柄用水沖洗干凈并表面消毒后，用滅菌水清洗干凈，然后使用滅菌水果刀將其切割成碎片，大小約（3.5～4.0）cm×（5.5～6.5）cm。使用相同的方法將黃瓜及馬鈴薯切成厚約0.5 cm薄片備用。

1.2.3.1 Y2的致病性測試

將大白菜葉柄碎片及黃瓜、馬鈴薯薄片放入預先鋪有濾紙且潤濕的無菌培養皿中，每皿1片。使用移液槍吸取1×108cfu/mL的Y2菌懸液注射待測試的組織，每塊組織碎片接種10 μL。重復3次，28℃恒溫培養24 h后觀察結果。

1.2.3.2 離體拮抗測試

預先將Y2與E1的菌懸液混合制備成混合接種液（終濃度均為1×108 cfu/mL）。采用上文方法將10 μL的混合接種液注射待測試的組織，接種等量無菌PBS緩沖液為陰性對照及E1重懸液（108 cfu/mL）為陽性對照。每個處理3次重復，28℃恒溫培養24 h后觀察結果，記錄腐爛斑塊與組織塊的面積并統計腐爛率。腐爛率=腐爛表面積/組織總表面積×100%。

1.2.4 Y2 在大白菜根圍和植株內的動態監測與回收 ?挑取Y2-gfp單菌落于LB（含10 μg/mL氯霉素）液體選擇性培養基中，37℃、160 r/min的條件下振蕩培養48 h。然后于12 000 g的條件下室溫離心2 min，棄上清收集菌體后加入等體積的無菌PBS緩沖液（pH 7.0）重懸菌體。相同方法重復離心1次，并使用PBS緩沖液重懸菌體至終濃度為1×107 cfu/mL，4℃保存備用。

將無菌自然土分裝入21 cm×21 cm的營養盆內，將健康飽滿的大白菜種子表面消毒[10]后播種。出苗7 d后，選取長勢一致的大白菜幼苗作為試驗材料，采用淋灌的方法接種Y2菌體懸浮液。淋灌：將Y2菌懸液自幼苗莖部輕柔自上淋下，每盆均勻淋灌100 mL Y2-gfp的重懸液，淋灌時須保持土壤浸潤但不能有水從盆底流出且不能濺至盆外。本試驗同時設立野生型Y2和無菌水兩個處理，每個處理設置3個重復。

在處理后第1、3、5、7、10、15、25、35、45天分別取樣，結合選擇性培養與光電折射儀，采用梯度稀釋涂板法回收監測標記菌在大白菜的根際土、根、莖以及葉的定殖數量[11-12]。

1.2.5 溫室防病試驗

1.2.5.1 生防育苗基質準備

生防育苗基質：加入一定量Y2菌懸液與自來水至商業育苗基質中（終濃度1×107 cfu/g 基質），充分混勻后裝入育苗盤內備用。普通育苗基質：加入等量的PBS緩沖液與自來水至商業育苗基質中，充分混勻后裝入育苗盤內備用。

1.2.5.2 漂浮育苗

參考汪漢成等[13]的方法進行育苗，略有改動。選取健康飽滿的大白菜種子表面消毒后播種于預裝有普通育苗基質或生防育苗基質的育苗盤（160孔/盤）中，然后分別放入專門的育苗池內生長（下文中兩處理的幼苗分別簡稱普通苗和生防苗）。每穴播種3顆種子，出苗3 d后每穴保留長勢一致的幼苗2株。待大白菜幼苗長至20 d苗齡時備用。

1.2.5.3 溫室試驗設計

從漂盤內選取長勢一致的大白菜幼苗移栽入溫室內，每塘種植1株。移栽后第2天按照以下4種方式處理：CK，移栽普通苗，每塘淋灌100 mL E1菌懸液（1×106 cfu/mL）;T1，移栽生防苗，每塘淋灌100 mL E1菌懸液（1×106 cfu/mL）;T2，移栽普通苗，每塘淋灌100 mL E1菌懸液（1×106 cfu/mL），同時分別于移栽后第2、9、16、23 天 淋灌100 mL Y2菌懸液（1×107 cfu/mL）;T3，移栽生防苗，后續處理方式與T1一致。溫室試驗地按面積劃分為12個小區（約20 m2/小區），3種處理方式均勻分布在試驗地內。

出苗60 d后采收大白菜，將所有大白菜小心拔起，用清水沖洗干凈后調查病株數、病情等級，計算發病率、病情指數、防治效果，稱量大白菜植株地上部鮮重并計算增產率[1，8]。

根據離體試驗中大白菜葉片被軟腐病原菌侵染后出現的表型，并參考大白菜軟腐病的單株分級標準[1]，將軟腐病情按嚴重程度分為以下5個等級：0級，無癥狀;1級，僅外圍葉片有極輕微的少量病斑，呈水浸狀;2級，外圍葉片有明顯可見的病斑;3級，外圍葉片部分腐爛且部分內部葉片有明顯可見的病斑;4級：植株大部分葉片葉柄大部分或全部腐爛。

發病率=病株數/調查總株數×100%;

病情指數=Σ（病情等級×病株數量）/（4×調查總株數）×100;

防治效果=（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數×100%;

大白菜增產率=（處理區地上部鮮重-對照區地上部鮮重）/對照區地上部鮮重×100%。

1.3 數據分析

運用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 Y2對大白菜軟腐病菌的抑制作用

24 h對峙培養后，與只接種PBS緩沖液相比，接種Y2菌懸液處理Y2菌落半徑為（6.1±0.2）mm，菌落周圍觀察到（8.4±0.3）mm的抑菌圈，表明Y2對果膠桿菌E1的生長有良好的抑制作用。

2.2 Y2離體生防活性潛力評估

2.2.1 Y2的無致病性測試

將Y2菌懸液注射接種至健康大白菜葉柄、黃瓜果實及馬鈴薯塊莖24 h后，均未觀察到浸漬癥狀（圖1b）。表明Y2不會引起軟腐病，可用于后續的生防試驗。

2.2.2 Y2離體生防活性測試

各處理間軟腐癥狀的嚴重程度差異顯著（圖1與表1）。與空白對照（圖1a，接種滅菌水）相比，接種果膠桿菌E1后，黃瓜、馬鈴薯及大白菜測試組織上均出現了可見的嚴重腐爛斑塊（圖1c），腐爛率分別達66.35%、35.34%及44.37%。然而，當植物組織接種入E1和Y2的混合接種液后，腐爛的面積均顯著減小（圖1d），其中黃瓜、馬鈴薯及大白菜測試組織的腐爛率分別下降了32.47%、11.67%及23.26%，離體防效依次達48.94%、33.02%及52.42%。

2.3 Y2-gfp在大白菜根際土壤及植株內的定殖能力

在淋灌生防菌Y2-gfp菌懸液1 d后，大白菜的根系內即可檢測到Y2-gfp菌株的存在，密度達1.4×103cfu/g根，隨著取樣時間的推移，根系內菌落密度呈現出“先上升后下降，最后維持穩定”的趨勢（圖2）。淋灌標記菌后第10 天，大白菜根系內Y2-gfp菌落密度達到頂峰（1.1×104 cfu/g根），此后逐漸下降，并在淋灌處理15 d后菌落定殖密度穩定在2×103～5×103 cfu/g。在大白菜的莖、葉及根際土壤中，Y2表現出相似的定殖規律，淋灌處理45 d后根際土壤中菌落數量仍然穩定在2×104cfu/g土壤。接種15 d后Y2-gfp在葉組織中的定殖密度始終高于莖組織（約3～5倍），這可能與大白菜的葉片內營養更豐富有關。

2.4 Y2對軟腐病防治效果

與空白對照相比，Y2所有處理的病情指數均顯著下降（P<0.05），有效地減輕了軟腐病對大白菜的危害（表2）。其中，僅移栽生防苗（T1）或移栽普通苗但淋灌Y2菌懸液（T2），并不減少軟腐病的發病率，而病情指數由對照組的67.36分別顯著下降到47.92及34.03，相應防治效果為28.87%與49.48%。移栽生防苗后連續淋灌4次生防菌懸浮液（T3）的防控效果最好，軟腐病的發病率、病情指數和防治效果分別為69.44%、25.44和62.23%，表明同時在育苗與栽培階段接種Y2更有利軟腐病的防控。不同處理的大白菜地上部產量總體上與其防病效果呈正相關，淋灌Y2的保產增收效果顯著高于僅移栽生防苗處理，其中T2和T3增產109.37%和146.58%，顯著高于T1的增產效果（47.52%）。

3 討論

隨著人類對農業生態、環境污染及食品安全的關注，開發高效低毒生防制劑替代化學農藥防控植物病害，特別是糧油作物病害逐漸成為現階段植保研究的熱點[14]，大量具有生防效應的微生物被開發成生防制劑用于農業生產[1，9]。本文以解淀粉芽胞桿菌Y2為材料研究了其對大白菜軟腐病的生防效果。Y2無論是在室內平板對峙，還是離體生防活性試驗中均能有效地抑制軟腐病病原菌的生長。在離體條件下，Y2在黃瓜、馬鈴薯與大白菜組織上對軟腐病都有良好的生防效果，離體防效分別為48.94%、33.02%及52.42%，這可能與Y2和果膠桿菌E1在不同作物組織上的生長及侵染速度不同有關[9]。離體試驗結果也表明Y2對不同作物有良好的適應性，Wang等[15]在廣東省發現一株解淀粉芽胞桿菌能夠侵染馬鈴薯并在其塊莖上形成典型的軟腐病癥狀，而Y2在離體條件下對黃瓜、馬鈴薯及大白菜測試組織均安全無害，展現出了防控軟腐病的生防潛力。

目前國內外利用生防菌來防治軟腐病有較多報道，但大多在室內抑菌效果較好，在田間生防效果不佳，或田間效果好但是防效不穩定，這可能是在復雜多變的田間環境中，生防菌的存活、定殖能力、與病原菌營養競爭能力及與土壤微生物協同共存受到威脅等有關[1，16]。本研究中使用綠色熒光標記菌株Y2-gfp為材料，研究其在大白菜根際土壤及植株內的定殖能力后發現，Y2通過淋灌后不僅能夠在植株根際土壤內存活，還能夠快速定殖到大白菜植株內，優先占據生態位點，在45 d后，細菌數量仍能穩定在103cfu/g組織，從而能夠有效發揮生防作用。故與對照相比，即使僅在漂浮育苗階段使用生防育苗基質（含Y2 103cfu/g基質），對軟腐病也有一定的防治效果（28.87%）;移栽生防苗后連續淋灌4次1×107cfu/mL的Y2菌懸液，防效達49.48%，它們的防治效果均低于移栽生防苗后淋灌同等濃度發酵液的處理（62.23%），后者出現雙重疊加防效，這可能與這種處理方式下育苗階段Y2已經占據大白菜根系、莖等組織的生態位點抑制病原菌的入侵[5，16]，同時溫室種植階段淋灌的Y2菌懸液又直接殺死大量病原菌或搶奪根際土壤內營養物質而影響病原菌的存活、繁殖有關[16-17]。無論是育苗階段，還是溫室種植階段，應用Y2后均可以使大白菜的產量增加47.52%～146.58%，提高品質，產量增加與對病害的防效呈正相關，這些試驗結果表明，合理的應用生防菌Y2，能夠有效地防控大白菜軟腐病，減少軟腐病造成的經濟損失，還為其他作物難防病害提供一個范例，即減少化學農藥的使用，在育苗與移栽后種植階段同時應用生防制劑，可以更高效地防控植物難防病害。

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（責任編輯： 田 喆）