茭白胡麻葉斑病病原菌分離與鑒定

黃婉琴 李勤 覃章輝

摘要 茭白胡麻葉斑病發(fā)生普遍且嚴(yán)重，已成為茭白的常見病害。為了明確病原菌，先后從茭白主產(chǎn)區(qū)采集胡麻葉斑病病葉，各產(chǎn)區(qū)分離純化5～10株病原菌。通過對(duì)菌株DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶GPDH基因、延伸因子EF-1α基因的序列進(jìn)行分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、致病力測(cè)定等方法對(duì)茭白胡麻葉斑病病菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，茭白胡麻葉斑病病原菌為稻平臍蠕孢Bipolaris oryzae，與水稻胡麻葉斑病病原菌一致。本文的研究成果可為茭白胡麻葉斑病的防治提供一種新的思路。

關(guān)鍵詞 茭白胡麻葉斑病; 病原菌鑒定; 稻平臍蠕孢

中圖分類號(hào)： S 436.45 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019060

Abstract Zizania latifolia leaf spot disease is a common and serious disease. In order to identify the pathogen， we collected infected leaves from different main production areas of Z. latifolia and selected 5 to 10 strains in each area. Identification experiments were performed based on DNA internal transcribed spacer ITS， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GDPH） and elongation factor EF-1α gene sequences and morphology. The results showed that the pathogen of leaf spot of Z. latifolia was Bipolaris oryzae， which was the same as the pathogen of rice flax leaf spot. This study provides a new idea for the control of leaf spot of Z. latifolia.

Key words Zizania latifolia leaf spot disease; pathogen identification; Bipolaris oryzae

茭白Zizania latifolia，又名高筍、茭瓜，是我國第二大水生蔬菜，也是我國特有蔬菜，經(jīng)濟(jì)效益非常顯著[1]。由Bipolaris oryzae引起的茭白胡麻葉斑病又稱茭白葉枯病，是近年來影響茭白產(chǎn)量的主要病害之一。隨著茭白種植面積逐年擴(kuò)大，該病的發(fā)生范圍也在不斷擴(kuò)大，在全國茭白主要種植區(qū)都普遍發(fā)生[2]，而且田間發(fā)生程度也越來越嚴(yán)重，特別嚴(yán)重時(shí)，株發(fā)病率達(dá)90%，病葉率達(dá)100%[1]。為了弄清不同茭白主產(chǎn)區(qū)胡麻葉斑病病原菌，本研究對(duì)茭白五個(gè)主產(chǎn)區(qū)的胡麻葉斑病菌進(jìn)行了分離純化、形態(tài)學(xué)觀察、致病力測(cè)定和分子鑒定，以期為茭白胡麻葉斑病的診斷、抗病育種以及病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要生物試劑及儀器

DNA提取的相關(guān)試劑、藥品購自大連寶生物公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。本試驗(yàn)所涉及引物均委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成，使用引物序列詳細(xì)信息見表1。

PCR擴(kuò)增儀（DNA Engine Peltier Thermal cycler，Bio-RAD）;水平電泳儀（DYY-6C，北京）;凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc TMImager，Bio-RAD）;微量分光光度計(jì)（Nano Drop 2000c，Thermo Scientific公司）;光學(xué)顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i，Nikon Instruments Inc）。

1.2 菌株采集與分離

在2016年7月-2017年11月期間共采樣8次，茭白胡麻葉斑病葉采自湖北武漢市與恩施州，浙江桐鄉(xiāng)縣與金華市，江西九江市，江蘇南通市與揚(yáng)州市以及廣西貴港市等茭白主產(chǎn)區(qū)。病原菌的分離純化方法參照組織分離法[3]，即：取茭白葉片病健交界處，剪切成5 mm×5 mm的小塊，用75%乙醇消毒30 s，滅菌水清洗3次后接種于PDA平板上，每皿4～5塊，置于28℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2～4 d，再純化菌株。將成功分離純化的病株用PDA培養(yǎng)基斜面接種保存后，在4℃冰箱中保存（本試驗(yàn)篩選菌株情況見表2）。

1.3 致病力測(cè)定

采用離體葉片接種法[4]，該試驗(yàn)共進(jìn)行2次，每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。在茭白生長初期取寬約2 cm的葉片進(jìn)行室內(nèi)人工接種試驗(yàn)。從田間采回葉片后剪取其中部約7 cm的一段，置于鋪有濕潤吸水紙的培養(yǎng)皿中，葉背朝上，用直徑為5 mm的菌絲塊進(jìn)行接種，每皿3組重復(fù)加1組PDA培養(yǎng)基瓊脂塊作為空白對(duì)照。接種后噴水霧，將培養(yǎng)皿蓋住保濕，置于28℃恒溫黑暗條件下，觀察24～96 h，待葉片出現(xiàn)染病狀態(tài)后將菌餅移除，96 h后對(duì)病斑進(jìn)行組織分離，觀察菌落形態(tài)以及在顯微鏡下觀察分離到的病菌是否與接種病菌相同。

1.4 菌株形態(tài)學(xué)特征觀察

將已分離純化的菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)3代后用打孔器沿菌落邊緣切取直徑為5 mm的菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)約15 d，期間觀察菌落的顏色以及在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)等。在病原菌長滿平板前在顯微鏡下觀察菌絲尖端，待長滿平板后，用無菌水將菌落表面的孢子洗下，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 菌株DNA的提取

菌株基因組DNA提取采用CTAB法[5]，核酸溶解后取100 ng產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余產(chǎn)物置于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因擴(kuò)增體系及條件

對(duì)溶解后的DNA核酸溶液進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，然后再進(jìn)行基因擴(kuò)增。EF-1α基因擴(kuò)增體系為25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs （2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加滅菌水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s ，58℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，循環(huán)30次;最后72℃延伸7 min?；騁PDH和基因ITS擴(kuò)增體系為25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加滅菌水至25 μL?；駿F-1α反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)40次;最后72℃延伸5 min?；騃TS反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;最后72℃延伸7 min。

由于EF-1α基因引物為簡并引物，故將其擴(kuò)增產(chǎn)物連T載體克隆后送武漢天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序檢測(cè)，其他基因?qū)U(kuò)增產(chǎn)物委托公司進(jìn)行雙向測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果分別得到菌株的EF-1α基因序列、ITS基因序列和GPDH基因序列。將測(cè)序結(jié)果用DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行分析，然后登錄NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLASTn后與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布相關(guān)屬種病原菌基因信息作同源性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茭白胡麻葉斑病病菌危害癥狀

茭白胡麻葉斑病一般出現(xiàn)在5月下旬到7月上旬之間，在6月下旬到7月中上旬發(fā)病速度明顯加快，7月中旬后開始進(jìn)入發(fā)病高峰期，到9月中旬發(fā)病速度開始變緩，進(jìn)入11月后發(fā)病逐漸停止[2]。在葉片發(fā)病初期，葉片上散生褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成狀如芝麻粒的褐色橢圓形或紡錘形病斑（圖1a）。病斑周圍呈黃褐色暈圈，時(shí)有輪紋，后期中心變灰白色。病情嚴(yán)重時(shí)葉片上分布著密密麻麻的病斑，甚至聯(lián)合成不規(guī)則的大斑，造成較大的壞死區(qū)，致使葉片由葉尖或葉緣向下或向內(nèi)逐漸枯死，最后葉片干枯。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長良好，初期菌落為灰白色，2～3 d后從中心開始變?yōu)榈疑▓D2a），之后逐漸擴(kuò)散，28℃黑暗培養(yǎng)7 d后，菌落能長滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿（圖2b）。長滿整個(gè)培養(yǎng)皿后菌絲變?yōu)楹志G色，最終菌落呈黑褐色，圓環(huán)形，菌絲絨毛狀，呈輻射狀展開，邊緣規(guī)則，中心部分或有氣生菌絲，或產(chǎn)生白色菌絲團(tuán)，培養(yǎng)15 d左右氣生菌絲鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。顯微鏡下分生孢子深黃褐色或淺褐色，長卵形、梭形或者倒棍棒形，光滑，正直或一側(cè)彎曲，兩端漸狹，鈍圓，4～9個(gè)假隔膜，臍部略突出，基部平截，長33～188 μm，寬6～41 μm（圖3）。菌絲尖端疏散鋪開，有向一側(cè)彎曲的分支，或短或長（圖4）。

2.3 致病力測(cè)定結(jié)果與分析

胡麻葉斑病病標(biāo)樣分離得到的37株菌株接種離體葉片致病力測(cè)定結(jié)果表明，所有菌株對(duì)茭白葉片均能致病，接種后發(fā)病率為100%。96 h時(shí)，病斑長度增加到3～5 cm左右。人工接種茭白和水稻葉片后，在葉片上表現(xiàn)的癥狀相同（圖1c）。

2.4 茭白胡麻斑病病原菌的分子鑒定

提取所有菌株基因組DNA且酶處理后，在220 V，45 min電泳條件下檢測(cè)基因組完整性。部分菌株檢測(cè)結(jié)果見圖5。

對(duì)提取成功的核酸進(jìn)行含量檢測(cè)，每個(gè)菌株取1 μg進(jìn)行特定基因擴(kuò)增。rDNA-ITS、GPDH和EF-1α基因目的條帶分別約580 bp、550 bp和1 000 bp（圖6）。擴(kuò)增后的電泳圖目的條帶片段大小跟預(yù)測(cè)值接近。

測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)37株菌株的rDNA-ITS基因序列完全一致，故選取BD73為代表菌株。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)BD73與稻平臍蠕孢M(jìn)FLUCC10-0694菌株MFLUCC10-0733菌株、MFLUCC13-0511菌株、MFLUCC10-0715菌株、CPC28828菌株、CPC28826菌株聚在一支。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株BD73與這些菌株的rDNA-ITS基因同源相似度在99%。

測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)37株菌株的GPDH基因序列完全一致，故選取BD73為代表菌株。根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)BD73與稻平臍蠕孢M(jìn)FLUCC13-0511菌株、BRIP：61686a菌株和平臍蠕孢有性態(tài)菌株WKIC聚在一支。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌株BD73與菌株MFLUCC13-0511的GPDH基因同源相似度在100%。

37株菌株的EF-1α基因序列有30種不同的序列，將這些序列進(jìn)行BLASTn比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)這些菌株均與B.oryzae/ATCC44560（99%）、B.oryzae/MFLUCC13-0511（99%）、B.austrostipae /BRIP 12490（99%）、B.zeicola/26-R-13（99%）、B.victoriae/FI3（99%）、B.woodii/BRIP 12239（99%）、A.alternata/UFAH00014（95%）、Alternaria sp./CBS 174.52（96%）、C.cassiicola/624.1相似，且相似度在95%以上。故選以上序列和不同序列的BD73、ES16、M12和TX33為代表菌株，構(gòu)建NJ樹。根據(jù)NJ樹結(jié)果，發(fā)現(xiàn)BD73、ES16、M12、TX33與稻平臍蠕孢菌株ATCC44560和菌株MFLUCC13-0511在同一支。

3 小結(jié)與討論

雖然茭白胡麻葉斑病在茭白葉片上危害程度非常嚴(yán)重，但由于茭白的地理分布以及種植分布的局限性。長期以來人們對(duì)于茭白胡麻葉斑病的重視程度不夠，導(dǎo)致對(duì)該病的研究較少。對(duì)于該菌的鑒定傳統(tǒng)方法為觀察病原菌分生孢子，通過測(cè)量分生孢子的長度來判斷種類[6-7];長于153 μm即認(rèn)定為菰平臍蠕孢，小于153 μm則認(rèn)定為稻平臍蠕孢[8]。后來發(fā)現(xiàn)根據(jù)形態(tài)分類并不準(zhǔn)確[9]，稻平臍蠕孢和菰平臍蠕孢的分生孢子大小并沒有明顯的界線將兩者分開。本次對(duì)茭白胡麻葉斑病病原菌的形態(tài)鑒定也證明了這點(diǎn)。在對(duì)所分離的樣本進(jìn)行形態(tài)特征觀察的過程中，采取PDA培養(yǎng)基作為病原菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)在PDA培養(yǎng)基上不同菌株產(chǎn)孢量差異較大，有些菌株甚至不產(chǎn)孢，因此很難單從形態(tài)學(xué)上鑒定是菰平臍蠕孢還是稻平臍蠕孢。關(guān)于菌株產(chǎn)孢量與菌株致病力的強(qiáng)弱、菌株不同來源等方面的潛在關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子分類學(xué)的方法開始應(yīng)用于真菌的鑒定與分類。近些年，已陸續(xù)有學(xué)者通過rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三個(gè)基因?qū)ζ侥毴滏邔偌捌湎嗨茖俜N進(jìn)行分類鑒定[10-12]。本研究對(duì)茭白胡麻葉斑病病原菌的rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三個(gè)基因序列分別進(jìn)行鑒定，將采自湖北、浙江、江蘇、江西和廣西五個(gè)主產(chǎn)區(qū)的茭白胡麻葉斑病的病原菌鑒定為稻平臍蠕孢Bipolaris oryzae，與水稻胡麻葉斑病病原菌[13]一致。本研究在對(duì)該病害病原菌的鑒定、侵染等方面的研究，可以結(jié)合水稻胡麻葉斑病的研究成果，為茭白胡麻葉斑病的防治提供新的思路。

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（責(zé)任編輯： 田 喆）