馬鈴薯塊莖病原真菌拮抗菌株篩選及優良拮抗菌株鑒定

陳星伊 崔凌霄 楊成德

摘要 從馬鈴薯塊莖上分離內生細菌，以塊莖病原真菌為指示菌，采用平板對峙法篩選拮抗菌株，并利用形態學特征和 16S rDNA 基因序列分析對優良拮抗菌株進行鑒定。結果表明，從定西馬鈴薯塊莖中共分離得到72株內生細菌，其中19株對5種塊莖病原真菌的抑菌率均高于51.87%，特別是內生細菌6-5和5-6分別對馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes和馬鈴薯黑痣病菌Rhizoctonia solani的抑菌率達85.82%和72.18%，且具有固氮和產吲哚乙酸（IAA）功能，其產IAA量分別為3.37 mg/L和19.25 mg/L;根據形態特征及16S rDNA基因序列將菌株5-6鑒定為萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus，菌株6-5鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis。

關鍵詞 馬鈴薯塊莖; 內生細菌; 分離; 抑菌功能; 鑒定

中圖分類號： S 476 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019017

Abstract In this study， endophytic bacteria were isolated from potato tubers， and tuber pathogenic fungi were used as indicator fungi. Antagonistic strains were screened by using tablet confrontation method， and excellent antagonistic strains were identified by morphological characteristics and 16S rDNA sequence analysis. The results showed that 72 endophytic bacteria were isolated from Dingxi potato tubers， and 19 of them had an inhibition rate of higher than 51.87% against 5 tuber pathogenic fungi; particularly， endophytic bacteria 6-5 and 5-6 had a bacteriostatic rate of 85.82% and 72.18% against Colletotrichum coccodes and Rhizoctonia solani， respectively. They had nitrogen fixation and IAA function， with an IAA yield of 3.37 mg/L and 19.25 mg/L， respectively. Based on morphological characteristics and 16S rDNA sequence， 5-6 and 6-5 were identified as Bacillus atrophaeus and Bacillus velezensis， respectively.

Key words potato tuber; endophytic bacteria; isolation; antibacterial function; identification

內生細菌 （endophyte）是指其生活史某一階段或全部階段生活于健康植物組織或器官的細胞間隙或細胞內的一類細菌，其可通過組織學方法從嚴格表面消毒的植物組織中分離獲得[1]。內生細菌可以通過抑菌、誘導產生次生代謝物、固氮、溶磷及產吲哚乙酸等多方面的有益生物功能，增強宿主植物抗病蟲害能力及生長競爭能力等[2-3]。內生細菌作為生防因子具有巨大優勢，是微生物資源開發應用中的又一資源庫。馬鈴薯是我國僅次于水稻、小麥和玉米的第四大農作物，且種植區域廣泛。2016年農業部又將馬鈴薯作為主糧作物進行產業化開發，使其已成為我國主要糧食作物和經濟作物。隨著馬鈴薯種植面積的擴大，其病害的發生也愈發嚴重，由于生物防治有諸多優點，因此利用內生細菌對馬鈴薯病害進行生物防治已成為目前研究的熱點之一，如楊成德等[4]從醉馬草中分離出6株對馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯壞疽病菌有拮抗作用的內生細菌，且同時具有固氮和產吲哚乙酸（IAA）能力，崔月貞等[5]從矮生蒿草中分離出內生細菌264AY1對馬鈴薯炭疽、壞疽及枯萎病具有防病促生作用，郭海等[6]報道了高寒草地牧草內生細菌對馬鈴薯炭疽病菌具有防病作用，暢濤等[7]也報道了珠芽蓼內生細菌對馬鈴薯晚疫病有防病促生作用。

但是，內生細菌的種類、數量及功能會因地區和宿主植物不同而有差異[8]。甘肅省定西市干旱少雨，這種特殊生境馬鈴薯塊莖內生細菌對塊莖病原真菌是否有抑菌能力以及抑菌能力如何尚不清楚，因此，本研究對甘肅省定西市馬鈴薯塊莖內生細菌進行分離，篩選塊莖病原真菌的拮抗菌株，并對優良拮抗菌株進行鑒定，以期為馬鈴薯內生細菌的開發利用奠定基礎，也為馬鈴薯塊莖病害生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試馬鈴薯內生細菌：分離自甘肅省定西市馬鈴薯塊莖。

供試病原菌：馬鈴薯黑痣病菌Rhizoctonia solani、馬鈴薯干腐病菌Fusarium solani、馬鈴薯壞疽病菌Phoma foveata、馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes和馬鈴薯枯萎病菌Fusarium avenaceum等，均由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及生物多樣性實驗室提供。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextroseagar，PDA）培養基，用于馬鈴薯炭疽病菌、壞疽病菌、黑痣病菌、干腐病菌和枯萎病菌培養及對峙培養; 肉汁胨（BPA）培養基[9]，用于馬鈴薯內生細菌的分離及活化。阿須貝無氮培養基[10]，用于測定內生細菌固氮功能。Pikovaskaias（PKO）培養基[11]，用于測定內生細菌溶磷功能。金氏培養基[10]，用于測定內生細菌產IAA能力。

1.2 馬鈴薯塊莖內生細菌的分離和純化

將馬鈴薯塊莖用自來水沖洗干凈，依次用75%乙醇表面消毒4 min和10%次氯酸鈉表面消毒1 min，再用無菌水漂洗塊莖3次;將消毒塊莖表面與固體平板接觸3～5 min，后放置于28℃的恒溫箱中培養3～5 d，若平板中無菌落生長，說明表面滅菌徹底，否則分離結果不可用;用打孔器（直徑=10 mm）從薯塊取出樣品，用無菌手術刀切取10 mm，置于研缽中研磨，加無菌水10 mL，靜置30 min后，梯度稀釋到濃度為10-1～10-4，取200 μL涂布于BPA平板，每濃度涂平板3個，置于28℃恒溫箱中培養，培養3～5 d后，挑取不同形態的菌落重新于固體平板上劃線純化，編號和保存，備用。內生細菌編號以馬鈴薯樣本號-內生細菌分離號表示，例如菌株6-5，6為馬鈴薯樣本編號，5為內生細菌分離編號。

1.3 拮抗菌株篩選

采用平板對峙培養法篩選拮抗菌株。將供試病原菌于PDA培養基上活化培養后，在菌落邊緣菌絲生長旺盛處打取直徑為0.6 cm的菌餅，接種在PDA培養基中央，再取經過48 h在BPA培養基中活化培養的拮抗菌點接于距菌餅3 cm處，每平板4點，3次重復，以只接種供試病原菌為對照，置于25℃生化培養箱中培養5～7 d，用十字交叉法測量菌落直徑，統計數據并計算抑菌率。

抑菌率=（對照真菌菌落直徑-受抑制真菌菌落直徑）/（對照真菌菌落直徑-0.6）×100%。

1.4 優良拮抗菌株生物功能測定

1.4.1 固氮能力測定

將優良拮抗內生細菌接種于阿須貝無氮平板和液體培養基內，以無菌水為對照，3次重復，平板置于28℃培養箱培養，液體培養基置于120 r/min振蕩培養，第7天平板上有菌落和液體培養基變渾濁者為陽性。

1.4.2 溶磷能力測定

將優良拮抗內生細菌點接于Pikovaskaias（PKO）培養基上，28℃培養14 d后觀察解磷圈，3次重復;根據解磷圈與菌落直徑比值大小確定其溶磷能力。

1.4.3 產IAA能力測定

定性測定：將優良拮抗內生細菌分別接種于含100 mg/L色氨酸和不含色氨酸的金氏培養液中，以加等量無菌水為對照，于28℃、120 r/min恒溫振蕩培養12 d，取50 μL加入等量比色液（PC比色液或S2比色液），室溫靜置15 min后，觀察顯色反應，3次重復均變紅色表示能分泌IAA。

定量測定：將培養12 d的菌懸液和對照離心（4℃，10 000 r/min，10 min），取4 mL上清液加入等量比色液，黑暗靜置30 min后測定OD530，重復測3次，以加比色液的空白對照調零。根據標準曲線計算優良拮抗內生細菌分泌IAA量。

1.5 優良拮抗細菌的鑒定

1.5.1 菌落形態特征觀察

在 BPA 固體培養基上劃線，置于28℃培養箱，48 h后觀察內生細菌菌落形態特征并描述和照相。

1.5.2 菌體形態觀察

將優良拮抗內生細菌在BPA 平板上培養18～24 h后革蘭氏染色，觀察菌體顏色和形態，并顯微拍照。

1.5.3 16S rDNA序列分析

提取優良拮抗內生細菌的基因組DNA并進行PCR擴增。利用gyrB基因引物：UP1S（5′GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′），UP2R（5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）[11]，采用50 μL 擴增反應體系：Taq Mixture 25 μL、引物UP1S和引物UP2R各 2 μL、DNA 模板 2 μL、ddH2O 19 μL。擴增條件：95℃ 預變性 3 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環;最后在 72℃ 下延伸10 min，終止反應。經檢測具特異性條帶的PCR擴增產物送西安擎科基因生物有限公司測序，所測序列與 GenBank 數據庫中序列進行同源性對比，采用 Clustal 1.8 軟件和 MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹，確定其系統發育學地位。

1.6 數據分析

運用 Excel 2007和SPSS 19.0 統計分析軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離純化

選取6個馬鈴薯樣本，從平板上依據菌落形狀、光澤、顏色和大小等挑取不同單菌落，多次劃線純化后共獲得72株內生細菌，編號保存備用;對照沒有細菌菌落長出，說明表面消毒徹底，所得細菌均為內生細菌。

2.2 拮抗菌株篩選

經對峙培養，72株內生細菌中有19株對5種供試病原菌的抑菌率在51.87%以上，占分離總數的26.38%，其中菌株6-5和5-6對5種指示菌均有較好拮抗作用，分別對馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯黑痣病菌抑菌率達85.82%和72.18%（圖1和表1）。故本試驗對其進行了下一步研究。

2.3 生物功能測定

5-6和6-5菌株不具有溶磷能力，具有固氮和產IAA能力，其中產IAA量分別為19.25 mg/L和3.37 mg/L。

2.4 內生細菌的鑒定

2.4.1 菌落形態

5-6菌株：菌落直徑1.5 mm，邊緣不規則，表面褶皺，呈火山狀突起，不透明，乳白色（圖2）。

6-5菌株：菌落直徑2.5 mm，邊緣不規則，表面黏稠無光澤，中間云霧狀散開，不透明，乳白色（圖2）。

2.4.2 菌體形態

19株拮抗內生細菌均為桿狀，4株為革蘭氏陰性菌，15株為革蘭氏陽性菌，其中5-6和6-5菌株均為革蘭氏陽性菌（表1和圖3）。

2.4.3 16S rDNA基因序列鑒定

通過測序，并與GenBank數據庫中序列比對和構建系統發育樹，5-6及6-5菌株分別與芽胞桿菌屬的 Bacillus atrophaeus（JQ916085）和Bacillus velezensis（LC191187）的一致性在99%以上，且在系統發育樹上聚在一起（圖4），初步將菌株5-6鑒定為萎縮芽胞桿菌Bacillus atrophaeus，菌株6-5鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis。

3 結論與討論

植物內生細菌是一個龐大的微生物類群， 種類繁多， 分布于宿主植物的不同部位[13]，可以誘導植物產生抗病性和促進植物生長，目前已經有許多內生細菌成功應用于植物病害防治[14]。本試驗從馬鈴薯塊莖中分離出72株內生細菌，與崔林等[9]從8個不同來源3個馬鈴薯品種塊莖中分離到240個內生菌株的結果相比較，本試驗分離數量較少，這可能與本試驗僅選用了一個地區一個品種的馬鈴薯有關，也可能是化學消毒劑殺死部分內生細菌，導致內生細菌數量和種類減少[15]，也與植株的生育期和栽培季節等有關[16]。

分離自馬鈴薯塊莖的72株內生細菌中有19株對5種病原真菌拮抗作用在51.87%以上，占總數的26.4%，與崔林等[9]報道的拮抗菌株占總數22.9%的結論相似。內生細菌的抑菌機制是其能產生多種不同的具有抗菌、抗病毒、殺蟲、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性的代謝產物[17]，此外，內生細菌還可以增加植物對生物或者非生物脅迫的耐受性[18]，但本試驗僅對菌株5-6與6-5的抑菌能力進行了測定，其代謝產物及抑菌機制等還需進一步研究。

目前已經鑒定的內生細菌超過50個屬[20]， 其中許多文獻報道從植株上分離出具有良好拮抗作用的芽胞桿菌[21-23]，其通過競爭營養和空間位點、產生抗菌物質、溶菌作用和誘導植物抗病性等方面來發揮其防病促生作用[24-26]。本試驗中，內生細菌對5株病原真菌均有良好的抑制作用，其中5-6與6-5均為芽胞桿菌，說明芽胞桿菌是內生細菌中主要拮抗細菌。

本試驗篩選的菌株5-6和6-5具有良好的抑菌作用，且具有固氮能力和產IAA能力，為馬鈴薯塊莖真菌病害的生物防治提供了菌種資源，也為馬鈴薯塊莖內生細菌資源的開發奠定了基礎。

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（責任編輯： 田 喆）