利用凝膠擴散法測定刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性

趙丹丹 楊龍 黃兆峰

摘要 β-甘露聚糖酶是種子萌發過程中降解胚乳細胞壁的關鍵酶，明確其活性的動態變化可為揭示雜草種子的休眠萌發機制提供重要依據。以外來雜草刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal種子為材料，建立了種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測方法—凝膠擴散法。利用凝膠擴散法對不同貯存時間及貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性進行了檢測，發現貯存3年以上的種子中該酶的活性為0.03 nmol/（min·mg），顯著低于貯存3年以下的種子中的酶活性0.15 nmol/（min·mg），而濕潤冷藏的種子中β-甘露聚糖酶的活性為0.12 nmol/（min·mg），顯著高于干燥冷藏的種子的酶活性0.02 nmol/（min·mg）。實際應用結果表明，凝膠擴散法綜合了傳統方法的優勢，檢測特異性強、靈敏度高、重復性好，可同時檢測大量種子樣品，具有良好的實用性。

關鍵詞 刺萼龍葵; β-甘露聚糖酶; 種子; 凝膠擴散法

中圖分類號： S 451.0 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019027

Abstract Endo-β-mannanase （EBM） is a key enzyme in degradation of endosperm cell walls during seed germination process. Understanding the dynamics of EBM activities will provide important guidance for elucidating the mechanisms of weed seed dormancy and germination. For determination of EBM activity in seeds of an invasive plant， Solanum rostratum Dunal （buffalobur）， a gel diffusion assay was established. The EBM activities in buffalobur seeds with different storage time and under different storage conditions were detected by this method. The results showed that the EBM activity in seeds stored longer than 3 years [0.03 nmol/（min·mg）] was significantly lower than that of seeds stored less than 3 years [0.15 nmol/（min·mg）]. Whereas for seeds stored wet in the refrigerator [0.12 nmol/（min·mg）]， the EBM activity was significantly higher than that of seeds stored dry in the refrigerator [0.02 nmol/（min·mg）]. The practical application verified that the gel diffusion assay， which took advantages of traditional methods， was a specific， highly sensitive and reproducible method， and could analyze a large number of seed samples simultaneously.

Key words Solanum rostratum; endo-β-mannanase; seed; gel diffusion assay

種子是雜草發生危害的根源和傳播擴散的重要載體，關系到種群的生存和發展[1-2]。種子內通常存在細胞壁加厚的胚乳細胞，可以阻礙胚根突破種皮，其細胞壁的降解是種子萌發的前提。β-甘露聚糖酶是降解胚乳細胞壁主要成分半乳甘露聚糖的關鍵酶，明確其活性的動態變化對揭示雜草種子的萌發調控機理，進而制定有針對性的雜草綜合防控措施具有重要意義。半乳甘露聚糖是大多數種子胚乳細胞壁的主要成分，在茄科植物種子中可達60%[3-4]。研究表明，β-甘露聚糖酶在番茄、萵苣、曼陀羅[5-7]等植物的種子萌發過程中發揮著重要作用，主要水解甘露聚糖主鏈之間的β-1，4共價鍵，側鏈及水解產物可由同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶協同降解[3，8]。由于β-甘露聚糖酶與種子的休眠萌發密切相關，其在20世紀70年代已引起國內外的廣泛關注，我國對該酶的研究主要集中在微生物發酵和飼料添加劑方面，在植物種子中的相關研究則較少[9-11]。

種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測是研究甘露聚糖酶的關鍵，其活性受內外因素影響較大，檢測結果也易受β-甘露聚糖酶同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶的影響。傳統β-甘露聚糖酶活性的測定主要有黏度測定法和分光光度法，前者準確度較高，但操作繁瑣、耗時長;后者對部分種子測定效果好，但通用性差、準確度低[12]。β-甘露聚糖酶對調控種子的萌發具有重要作用，明確種子萌發過程中β-甘露聚糖酶活性的動態變化，可為揭示外來雜草刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal種子的休眠萌發機制提供依據。采用傳統方法測定β-甘露聚糖酶活性時適用性和效率不高，因此有必要建立一種可靠、有效的檢測方法。本研究以刺萼龍葵種子為研究對象，基于Downie等[13]和Still等[14]的凝膠擴散法，擬優化建立一種靈敏度高、操作簡便的測定方法，實現對種子中β-甘露聚糖酶活性的準確和高效檢測。

1 材料與方法

1.1 種子來源與處理

2007年-2011年連續5年在北京采集成熟刺萼龍葵種子，并對2007年種子分別采用濕潤冷藏（4℃）、干燥冷藏（4℃）和室溫干燥（25℃）3種貯存方式備用。待測種子處理時2007年-2011年貯存的種子相應的貯存年限為5年～1年。剔除有機械損傷的種子和雜物，每處理選取30粒種子用蒸餾水反復沖洗3次、1%次氯酸鈉浸泡10 min，再將種子轉移至墊有兩層濾紙、含5 mL蒸餾水的直徑為9 cm的培養皿中，置于培養箱內30℃、黑暗條件下培養。分別選取相同培養時間的種子進行β-甘露聚糖酶活性的測定。

1.2 凝膠擴散法基本方法與原理

將含有β-甘露聚糖酶的種子粗酶提取液置于含有該酶專一性底物-甘露聚糖的瓊脂糖培養基中，通過粗酶提取液中的β-甘露聚糖酶與底物接觸，培養催化種子粗酶液水解底物。由于β-甘露聚糖酶的水解作用可使水解后的底物與染色劑剛果紅的結合能力喪失，利用底物與剛果紅結合能力的差異進行染色，可在凝膠上形成明顯的透明消化圈。根據透明消化圈直徑大小與β-甘露聚糖酶活性的線性關系，可以確定待測種子中酶活性的強弱[13，15]。

1.3 刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的測定

參照Downie等[13]和Still等[14]的凝膠擴散法，按照以下試驗步驟進行刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活力的測定。

1.3.1 凝膠制作

用0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5）配制濃度為0.05%（m/V） LBG（Locust bean gum）溶液，置于95℃的水浴鍋中保溫并攪拌30 min，隨后停止加熱，冷卻并將懸浮液轉移至50 mL離心管中，于4℃、11 000 g離心15 min。取離心后上清液配制0.8%（m/V）的瓊脂糖溶液，微波加熱溶解，冷卻至65℃左右，取27 mL上述溶液倒入水平放置的規格為100 mm×100 mm×15 mm的一次性方形培養皿中，凝膠厚度為5 mm。室溫下聚合1 h后，用直徑為2 mm的凝膠打孔器在培養皿內的凝膠上均勻打36孔，移除孔中殘留的凝膠，封閉培養皿保濕備用。

1.3.2 種子中β-甘露聚糖酶粗酶液的提取

針對不同貯存時間和貯存方式的刺萼龍葵種子，各取培養5 d的種子30粒，用解剖刀將種子的胚（含胚乳，去除種皮）逐一分離，用研缽碾碎并轉移至1.5 mL離心管中，加入300 μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5），于30℃黑暗孵育培養2 h，得到含β-甘露聚糖酶的種子粗酶液。

1.3.3 水解反應

分別向制好的培養皿凝膠小孔中加入2 μL含β-甘露聚糖酶的種子粗酶液上清液，以等體積的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5）為對照，然后用封口膜密封培養皿并將其轉移至具蓋白瓷盤，瓷盤中放入單層濾紙并加適量的蒸餾水保持濕度（必要時可補加蒸餾水），密閉瓷盤，于30℃黑暗條件下保溫、保濕處理20 h。

1.3.4 剛果紅顯色

取出經保溫、保濕處理后的培養皿，加入10 mL 0.5%（m/V）的剛果紅染色液，置于水平搖床60 r/min、30℃染色20 min，移出染色液，蒸餾水輕柔洗滌1 min，接著將凝膠用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=7）緩慢振蕩洗滌1～2 min，可清楚地顯示出水解消化圈，然后用80%乙醇洗滌使消化圈邊緣清晰。將顯色凝膠置于掃描儀（EPSON STD 4800）中進行圖像掃描，消化圈直徑利用WinSeedle系統進行測量。

1.3.5 β-甘露聚糖酶標準曲線的制作

為建立β-甘露聚糖酶活性與底物消化圈直徑間的定量關系曲線，將β-甘露聚糖酶標準品（酶活性46 U/mg，Megazyme公司）用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5）梯度稀釋至5 000、50 000、100 000、200 000、400 000、800 000、1 600 000倍。分別取2 μL稀釋的標準β-甘露聚糖酶酶液，以稀釋所用的緩沖液為對照，按1.3.3、1.3.4的步驟進行水解和剛果紅顯色反應。根據β-甘露聚糖酶標準品說明及酶活性相關規定[16]，酶活性單位U定義為：在一定條件下每分鐘水解底物甘露聚糖形成1 μmol甘露糖時所需的β-甘露聚糖酶為1個酶活性單位，即1 U=1 μmol/（min·mg）=1 000 nmol/（min·mg）。β-甘露聚糖酶標準品的活性為46 000 nmol/（min·mg），則梯度稀釋后的酶活性依次為9.2、0.92、0.46、0.23、0.115、0.057 5、0.028 75 nmol/（min·mg）。以水解消化圈的直徑為橫坐標，不同稀釋倍數的標準β-甘露聚糖酶的活性為縱坐標作圖，擬合方程可得β-甘露聚糖酶的標準曲線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的擬合和建立

不同稀釋倍數的標準β-甘露聚糖酶可在含專一性底物甘露聚糖的凝膠上水解產生不同大小的透明消化圈，消化圈直徑與酶活性呈顯著的正相關，酶活性越高消化圈直徑越大，酶活性越低則消化圈直徑越小。對不同標準β-甘露聚糖酶的梯度酶活性與消化圈直徑進行線性擬合，分析比較不同的擬合方程，發現底物消化圈直徑（x）與酶活性（y）的擬合曲線為指數方程時效果最佳，據此建立了相關的標準曲線方程為y=0.004 1e0.392 6x（R2=0.967） （圖1）。

2.2 刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測

2.2.1 貯存時間對β-甘露聚糖酶活性的影響

應用改進的凝膠擴散法測定了不同貯存時間的刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性。結果表明，種子中β-甘露聚糖酶的活性隨貯存時間的增加呈現下降的趨勢，其中貯存5年（2007年）的種子中該酶的活性為0.03 nmol/（min·mg），顯著低于貯存1年（2011年）的種子中酶的活性0.15 nmol/（min·mg）。總體來看，貯存3年以內的種子（2009年-2011年）中β-甘露聚糖酶的活性差異不顯著，但均顯著高于貯存3年以上的種子中該酶的活性，說明刺萼龍葵種子貯存3年以后，種子中β-甘露聚糖酶的活性開始出現顯著降低（圖2）。

2.2.2 貯存條件對β-甘露聚糖酶活性的影響

對不同貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性進行了測定，結果表明，不同處理間種子中β-甘露聚糖酶的活性存在顯著差異。濕潤冷藏的種子中該酶活性為0.12 nmol/（min·mg），高于干燥冷藏和干燥室溫貯存的種子中的酶活性，后二者分別為0.02和0.03 nmol/（min·mg）（圖3）。從以上結果可以看出，貯存條件會顯著影響刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性，進而影響其種子的休眠萌發特性。

3 討論

已有研究表明，β-甘露聚糖酶與植物種子休眠萌發密切相關，在種子細胞壁的降解和休眠解除方面具有重要作用[5，17-18]。明確β-甘露聚糖酶影響雜草種子休眠和萌發的機制，對雜草發生和出苗進行預測和合理調控，將為雜草的綜合治理提供重要依據[19]。建立可靠、有效的種子中β-甘露聚糖酶活性檢測方法，是開展相關研究的關鍵。

分光光度法（即DNS法）主要利用3，5-二硝基水楊酸與還原糖在堿性條件下的顏色反應，對β-甘露聚糖酶活力進行測定。該方法盡管測定流程較為簡單，但由于種子粗酶液中除了β-甘露聚糖酶外，還同時存在同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶，可以對β-甘露聚糖酶水解產物進一步消化產生還原糖，造成測定結果不準確[3，12，20]。黏度測定法利用底物消化反應前后黏度的變化，對β-甘露聚糖酶活力進行測定。盡管可檢測到較低的酶活，但同樣易受β-甘露聚糖酶的同工酶影響，并且樣品逐一檢測，效率較低[15]。因而上述兩種傳統方法在測定β-甘露聚糖酶的實際應用過程中均受到不同程度的限制。

與傳統方法相比，凝膠擴散法采用了剛果紅顯色和專一性底物LBG，可降低種子粗酶液中同工酶的干擾，特異性強，降低了實驗誤差。凝膠擴散法檢測靈敏度高，可檢測稀釋至160萬倍的標準酶活力0.029 nmol/（min·mg），且檢測過程中重復性好，可同時對大批量種子樣品進行酶活性測定，檢測成本較低、效率較高。凝膠擴散法綜合了傳統分光光度法效率較高和黏度測定法靈敏度較高的優勢，準確可靠，具有較好的實用和推廣價值。由于種子大小及胚和胚乳成分不同，凝膠擴散法是否可用于其他種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測，不同種子的反應體系是否應做相應調整，還有待進一步的研究。

4 結論

本研究建立了檢測外來雜草刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的凝膠擴散法，可同時檢測多個種子樣品，檢測方法靈敏度高、重復性好，具有良好的實用性。該方法的建立為不同貯存時間和貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測提供了技術支撐，為刺萼龍葵種子休眠水平的動態監測及其種子季節性休眠機制的闡明提供了科學的參考依據。

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（責任編輯： 田 喆）