蚜蟲共生細菌多重PCR檢測體系的建立

李彤 蔣月麗 連紅梅

摘要 蚜蟲中具有多種共生菌，使用常規PCR對它們進行檢測，耗時耗力，而多重PCR可以更加高效地進行多種細菌的檢測。沃爾巴克氏菌Wolbachia pipientis、殺雄菌屬共生菌Arsenophonus和蚜蟲U型共生菌Regiella insecticola是蚜蟲中常見的3種共生菌。本研究針對沃爾巴克氏菌、殺雄菌屬共生菌和蚜蟲U型共生菌，分別選擇以wsp基因、yaeT基因和gltA基因作為靶標，進行了多重PCR引物的設計和擴增體系的優化。結果顯示，本研究建立的多重PCR體系在檢測3種蚜蟲常見共生菌時，具有較高的擴增特異性、準確性和直觀性及較高的檢測靈敏度，共生菌的最低檢測濃度為104拷貝/μL，遠低于共生菌在蚜蟲1齡若蟲總DNA中的濃度（108拷貝/μL），可以完全滿足蚜蟲共生菌檢測工作的需要。

關鍵詞 沃爾巴克氏菌; 殺雄菌屬共生菌; 蚜蟲U型共生菌; 多重PCR

中圖分類號： S 433.3 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019069

Abstract Aphids harbor many bacterial symbionts. Although conventional PCR is universally used in the detection of aphid bacterial symbionts， however， it is a time-consuming way when multiple aphid bacterial symbionts should be detected in the same sample. Previous researches revealed that the multiplex PCR had high efficiency in the multiple bacteria detections. Wolbachia， Arsenophonus and Regiella insecticola are the three universal bacterial symbionts in aphids. In this study， we employ three protein coding genes， wsp， yaeT and gltA， as targets to design the multiplex PCR primers and establish an optimized detection system. The results showed that the multiplex PCR system established in this study had high amplification specificity and accuracy in the detection of the three aphid bacterial symbionts. Moreover， the minimum detection concentration of symbiotic bacteria was 104 copies/μL， lower than that of that in the total DNA of the first instar aphid， 108 copies/μL， indicating that the multiplex PCR system also had the high sensitivity in the bacterial symbionts detection， which will fully meet the requirements in the detection of aphid bacterial symbionts.

Key words Wolbachia pipientis; Arsenophonus; Regiella insecticola; multiplex PCR

蚜蟲屬半翅目，胸喙亞目Sternorrhyncha，是一類重要的經濟害蟲[1]。蚜蟲主要以植物韌皮部的汁液為食，而植物韌皮部汁液是一類營養極其不均衡的食物，富含碳水化合物，卻缺少動物生長發育所必須的氨基酸[2]。蚜蟲和細菌的關系密切，幾乎所有的蚜蟲中都含有一種可遺傳的共生細菌——Buchnera aphidicola[3]。研究表明，B.aphidicola可以合成蚜蟲生長發育所需的氨基酸，它和蚜蟲寄主之間具有專性共生的關系[4-5]。相對于專性共生菌，蚜蟲中還存在另外一類具有垂直傳播能力的共生細菌，由于它們和蚜蟲之間不存在專性共生的關系，因此被統稱為蚜蟲兼性共生菌。蚜蟲兼性共生菌具有多樣化的生態學功能，如增強蚜蟲對高溫的忍耐[6]，增強蚜蟲對寄生蜂寄生和真菌感染的抵抗能力[7-8]，擴大蚜蟲的寄主范圍[9]等。

蚜蟲共生菌對生存環境要求苛刻，基本上都不能在蚜蟲體外進行純培養，因此目前已知的蚜蟲共生菌都是通過使用分子手段進行鑒定的[10]。共生菌已經被認為是蚜蟲體內另外一種遺傳變異的來源[11]，以其為對象開展的蚜蟲種群遺傳結構分析、真核和原核生物互作，以及利用共生菌作為介體開展對蚜蟲的生物防治都是目前國內外研究的熱點[11-13]。而對蚜蟲中共生菌的物種進行快速、準確的鑒定，是開展上述研究工作的前提。

在前期的研究工作中，研究者基本上都是使用常規PCR檢測方法，合成單對引物對單個蚜蟲共生菌進行鑒定，而1次PCR擴增只能在單個樣品中檢測到1種共生菌。但是，在實際調查研究中，往往需要同時在多達幾百個，甚至上千個蚜蟲樣品中檢測多種共生菌。因此，使用常規PCR開展蚜蟲共生菌物種的多樣性檢測，需要耗費大量的人力物力。而依托于多個細菌物種基因設計和優化的多重PCR體系，可以一次在單個樣品中檢測多個細菌物種，是一種高效的分子檢測方法，并已經廣泛應用在環境微生物和病原微生物檢測中[14-16]。沃爾巴克氏菌Wolbachia pipientis、殺雄菌屬共生菌Arsenophonus和蚜蟲U型共生菌Regiella insecticola是蚜蟲中常見的3種共生菌[17-19]。本研究中，針對它們設計和優化了一套能快速、準確、直觀并兼有高靈敏度的多重PCR反應體系，可以通過一次多重PCR擴增，揭示待測蚜蟲中3種共生菌的感染情況，為今后開展蚜蟲共生菌的檢測工作提供了極大的便利，并節省大量的成本。

1 材料和方法

1.1 供試蚜蟲材料

使用的蚜蟲材料是2013年4月采集自河南鄭州、原陽麥田的麥長管蚜（又稱荻草谷網蚜）Sitobion miscanthi和禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi，隨后在實驗室進行單雌飼養，檢測其共生菌感染情況。建立了室內單獨感染沃爾巴克氏菌和殺雄菌屬共生菌的禾谷縊管蚜種群;單獨感染蚜蟲U型共生菌的麥長管蚜種群;未感染共生菌的麥長管蚜對照種群。

1.2 蚜蟲樣品總DNA的提取

取出飼養的單頭蚜蟲，在75%乙醇中進行多次漂洗以除去蚜蟲表面菌污染，然后在無菌水中浸泡1～2 h去除乙醇。使用滅菌的移液器槍頭對蚜蟲樣品進行研磨，然后使用動物組織和細菌通用DNA提取試劑盒進行總DNA的提?。‥asyPure Genomic DNA Extraction Kit，北京全式金生物技術有限公司），提取后的蚜蟲樣品總DNA置于4℃保存備用。

1.3 PCR引物設計

使用3個蛋白質編碼基因作為靶標開展相關的多重PCR引物組合的設計。wsp基因編碼外膜蛋白，是國際上對沃爾巴克氏菌進行檢測和分型的通用基因[20];yaeT基因編碼外膜蛋白組裝因子，已經廣泛應用于殺雄菌屬共生菌株系的多基因分型[18];gltA基因編碼細菌中的檸檬酸合成酶，已經成功用于蚜蟲U型共生菌的檢測[21]。本研究設計的引物序列見表1。

1.4 常規PCR

1.4.1 引物濃度梯度篩選

PCR擴增反應體系為50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游單基因引物各1～2.0 μL，DNA模板1 μL，25 mmol/L的 MgCl2 3 μL，去離子水補至50 μL。

PCR擴增反應條件為：94℃預變性4 min;94℃變性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃延伸10 min。

1.4.2 克隆和測序

目的片段使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金生物技術有限公司）進行純化回收;將回收片段與pEASY -T1 Simple Cloning Vector（北京全式金生物技術有限公司）按照載體說明書要求的體系進行混合，在25℃連接10 min，隨后轉化到E. coli Top10感受態細胞中，培養10 h;使用M13-F：5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′和M13-R：5′- CAGGAAACAGCTATGAC-3′篩選陽性克隆，送往上海生工（生物工程股份有限公司）測序。

測序結果使用MEGA 5（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件進行拼接[22]，并進一步在GenBank中使用BLASTn進行比對分析，確定其序列來源。

1.4.3 質粒標準品構建

使用質粒提取試劑盒（EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，北京全式金生物技術有限公司）提取陽性克隆中的質粒，然后將質粒濃度分別稀釋為102、103、104、105拷貝/μL的標準品。

1.5 多重PCR

1.5.1 引物濃度梯度篩選

PCR擴增反應體系為50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游多基因引物各1～2.0 μL，104拷貝/μL的混合質粒模板1 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，去離子水補至50 μL。

PCR擴增反應條件為：94℃預變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃延伸10 min。

1.5.2 引物擴增靈敏度

分別以濃度為102、103、104、105拷貝/μL的混合質粒為模板，進行多重PCR擴增反應，考察多重PCR檢測模板的靈敏度。

PCR擴增反應的反應體系為50 μL：10×PCR Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl）5 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4 μL，5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L的上、下游多基因引物各2.0 μL，混合質粒模板1 μL，25 mmol/L的MgCl2 3 μL，去離子水補至50 μL。

PCR擴增反應的反應條件為：94℃預變性4 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;72℃延伸10 min。

1.5.3 多重PCR檢測蚜蟲樣品中共生菌的感染情況

分別以單獨感染沃爾巴克氏菌的禾谷縊管蚜的總DNA、單獨感染殺雄菌屬共生菌的禾谷縊管蚜的總DNA、單獨感染蚜蟲U型共生菌的麥長管蚜的總DNA和未感染共生菌的麥長管蚜的總DNA為模板，判斷多重PCR反應體系對蚜蟲共生菌感染檢測的效果。

2 結果與分析

2.1 常規PCR結果

如圖1中1～6泳道所示，3種共生菌在單引物擴增時均未出現非特異擴增條帶，說明引物具有較高的特異性;而且引物濃度對單引物擴增結果影響不大。將克隆測序結果在GenBank中進行BLASTn比對分析，結果顯示其最相似的序列均為相關蚜蟲共生菌的序列，進一步確定了常規PCR擴增結果的準確性。

2.2 多重PCR結果

如圖1中7～8泳道所示，多重引物對組在擴增時均未出現非特異擴增條帶，具有較高的特異性，而且引物濃度為0.4 μmol/L相對于0.2 μmol/L有較好的擴增效果。如圖1中泳道10～13所示，本研究設計的多重PCR反應體系最低可以檢測到濃度為104 拷貝/μL分別含有wsp基因、yaeT基因、gltA基因的混合質粒，具有較高的檢測靈敏度。

進一步在蚜蟲總DNA中驗證了多重PCR擴增體系檢測蚜蟲樣品中共生菌感染情況的可行性。結果（圖2）顯示，在感染共生菌的蚜蟲樣品中均擴增出了特異性條帶，而在未感染蚜蟲共生菌的樣品中無擴增條帶。而且擴增片段間長度差異都超過100 bp，普通的瓊脂糖凝膠電泳就可以完全清楚分辨不同的擴增產物，從而直觀地反映出待測的蚜蟲樣品中共生菌的感染情況。

3 結論與討論

細菌是世界上種類最多，分布最廣的一類微生物，研究發現僅在健康人體皮膚表面就分布有約1 000種細菌[23]，而昆蟲作為物種多樣性最豐富的動物類群，和細菌之間也具有密切的聯系[24]。蚜蟲，是較早開展共生菌研究的昆蟲類群之一，早在20世紀60年代，研究者就通過顯微鏡觀察到蚜蟲體內具有多種形態的共生細菌[25]。近20年里，以細菌16S rRNA 基因作為主要的分子標記，研究者已經在蚜蟲中鑒定了多種共生菌，它們分別屬于不同的細菌類群，包括α變形菌綱[26-27]，γ變形菌綱[18-19]和柔膜菌綱[28]。在前期的研究中，研究人員基本上都是針對特定蚜蟲共生菌合成特異的16S rRNA基因引物，使用常規PCR方法進行下游的共生菌檢測和鑒定工作。在蚜蟲共生菌相關的研究中，往往需要對多個樣品和多種共生菌進行檢測，使用常規PCR方法就顯得耗時耗力。而利用多個引物組合構建的多重PCR體系已經廣泛應用在環境微生物和致病微生物的高效檢測和鑒定工作中。

本研究中，我們針對3種常見的蚜蟲共生菌，沃爾巴克氏菌、殺雄菌屬共生菌和蚜蟲U型共生菌，分別選擇在其相關研究中經常使用的3種蛋白質編碼基因，wsp基因、yaeT基因和gltA基因作為目標基因進行了多重PCR擴增引物的設計，通過常規PCR擴增和克隆測序，確定了引物擴增的特異性和準確性，并進一步優化了多重PCR擴增體系。本研究中構建的多重PCR反應體系最低可以檢測到的共生菌濃度為104拷貝/μL。而前期的研究發現，共生菌在蚜蟲1齡若蟲總DNA中的濃度就超過了108拷貝/μL[29-30]。因此，本研究設計的多重PCR反應體系具有較高的擴增靈敏度，完全可以滿足在蚜蟲樣品中進行3種常見共生菌的檢測，并大大降低了工作量，提升了工作效率，節省了相關的檢測費用。本研究中，我們使用已建立的多重PCR反應體系，在禾谷縊管蚜和麥長管蚜樣品中進行了共生菌的感染檢測，結果顯示，和常規檢測結果一致，也并未出現非特異擴增，具有較高的共生菌感染檢測特異性。但是，需要注意的是，由于不同蚜蟲種類的遺傳背景存在著差異，因此，建議在其他蚜蟲種類中使用本研究建立的多重PCR反應體系時，先對擴增產物進行測序，確定序列來源，避免假陽性結果。另外，在將來的研究中，我們也將針對其他蚜蟲共生菌，設計出可以和本研究多重PCR反應體系相兼容的檢測系統，進一步簡化蚜蟲共生菌的檢測和鑒定工作。

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（責任編輯： 田 喆）