加強(qiáng)果樹規(guī)范化采樣和病毒檢測(cè) 降低潛隱和危險(xiǎn)性病毒對(duì)我國蘋果產(chǎn)業(yè)的危害風(fēng)險(xiǎn)

董云浩 謝吉鵬 李夢(mèng)菲

摘要 蘋果病毒病在世界各蘋果產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生，危害嚴(yán)重，目前沒有有效的防治藥劑。蘋果病毒具有潛隱危害、主要以嫁接方式傳播的特點(diǎn)。危險(xiǎn)性高的類病毒侵染導(dǎo)致蘋果果實(shí)幾乎失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蘋果病毒的檢測(cè)是防止其傳播和危害，繁育無病毒苗木和蘋果樹無毒化管理的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。由于對(duì)病毒在蘋果樹體中的組織分布和濃度認(rèn)知不到位，蘋果病毒檢測(cè)中存在樣品采集和檢測(cè)方法的誤區(qū)。本文根據(jù)課題組十年來開展蘋果病毒檢測(cè)和研究工作的數(shù)據(jù)，簡要概述了我國蘋果病毒的發(fā)生危害特點(diǎn)，蘋果病毒檢測(cè)方法，詳細(xì)給出了規(guī)范的樣品采集、處理、總RNA提取、RT-PCR參數(shù)、檢測(cè)引物、對(duì)照設(shè)置及檢測(cè)結(jié)果判別的技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞 蘋果病毒; 潛隱病毒; 暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn); RT-PCR; 檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S 432.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019011

Abstract Virus diseases on apple trees occur worldwide and induce severe losses. To date， no pesticides are effective for virus diseases. Apple viruses cause latent infection and mainly transmit by grafting. Dangerous viroids infection may result in complete loss of economic value of apple fruit. Detection of apple viruses is effective to control their transmission and acts one of key measures for both virus-free seedling propagation and apple tree management. As there is a gap to know the tissue distribution and titer of viruses in apple trees， there are some misunderstandings for sample collection and detection methods. Here， based on our research and detection work on apple viruses for ten years， we briefly introduced the occurrence characteristics of apple viruses in China， detection methods， and the standard technical methods in detail that cover sample collection， processing， total RNA isolation， RT-PCR parameters， controls and results analysis. The detection primers were fully listed.

Key words apple virus; latent viruses; risk of outbreak; RT-PCR; detection

蘋果病毒病在世界各蘋果產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生，具有危害性強(qiáng)、傳播擴(kuò)散快的特點(diǎn)。病毒破壞和干擾果樹正常生理功能，導(dǎo)致樹勢(shì)減弱，產(chǎn)量降低，果實(shí)畸形、著色不勻、品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。國外自20世紀(jì)40年代已開始了對(duì)蘋果病毒病的調(diào)查研究，目前多數(shù)蘋果主要生產(chǎn)國基本上實(shí)現(xiàn)了蘋果的無毒化栽培[4]。我國對(duì)蘋果病毒病的研究起步較晚，雖然目前基本明確了我國蘋果主產(chǎn)區(qū)病毒病的種類、分布，建立了病毒檢測(cè)方法，但由于蘋果病毒在樹體中的含量低，分布和濃度因季節(jié)和組織而異，同時(shí)蘋果病毒序列變異大，此外，檢測(cè)中通常未設(shè)內(nèi)參基因做對(duì)照，導(dǎo)致檢測(cè)假性率高，數(shù)據(jù)不一致，制約了我國蘋果病毒病可持續(xù)控制。

當(dāng)前正值我國大面積推廣矮砧密植蘋果栽培方式，其育苗過程中要通過兩次嫁接來實(shí)現(xiàn)早結(jié)果和早豐產(chǎn)。這種通過兩次嫁接培育蘋果苗的方法大大增加了病毒傳播和復(fù)合侵染的幾率。同時(shí)由于新建果園和需更新的果園面積大，苗木需求量巨大，市場基本無秩序和無監(jiān)管，使得矮砧苗病毒病問題愈發(fā)嚴(yán)重，已危及我國蘋果苗木的健康繁育，給我國蘋果安全生產(chǎn)帶來了極大的風(fēng)險(xiǎn)。利用無病毒苗木和加強(qiáng)病毒檢測(cè)是目前控制蘋果病毒病和防止其傳播擴(kuò)散的有效途徑，特別是對(duì)采穗母本樹實(shí)施病毒檢測(cè)，是確保蘋果苗木低毒化、無毒化和提升果品質(zhì)量的關(guān)鍵。

本文根據(jù)課題組十年來開展蘋果病毒檢測(cè)和研究工作中取得的數(shù)據(jù)及發(fā)表的文章，首先概述了我國蘋果病毒的發(fā)生危害特點(diǎn)，列舉了檢測(cè)方法，然后在整理、綜合國內(nèi)外研究建立的反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測(cè)蘋果病毒技術(shù)的基礎(chǔ)上，給出規(guī)范的從樣品采集、處理、總RNA提取、RT-PCR參數(shù)、檢測(cè)引物、對(duì)照設(shè)置到檢測(cè)結(jié)果判別的技術(shù)方法，供蘋果病毒相關(guān)研究和育苗栽培生產(chǎn)中參考使用。

1 我國蘋果病毒的種類及發(fā)生特點(diǎn)

根據(jù)對(duì)我國蘋果主要產(chǎn)區(qū)（環(huán)渤海灣產(chǎn)區(qū)、黃土高原產(chǎn)區(qū)、黃河故道產(chǎn)區(qū)和西南高地產(chǎn)區(qū)）病毒病多年來的調(diào)查結(jié)果和病原檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，明確了我國蘋果上發(fā)生的病毒種類和特點(diǎn)。一是病毒種類多。已明確的我國蘋果上發(fā)生的主要病毒有6種，分別是蘋果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus（ACLSV）、蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus（ASGV）、蘋果莖痘病毒Apple stem pitting virus（ASPV）、蘋果壞死花葉病毒Apple necrosis mosaic virus（ApNMV）、蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）和蘋果凹果類病毒Apple dimple fruit viroid（ADFVd）[3，5-7]。其中，前三種（ACLSV、ASGV和ASPV）侵染蘋果通常不引起明顯的癥狀，因此也稱為潛隱病毒。ApNMV是最近鑒定的引起我國蘋果花葉病的主要病毒[7];ASSVd和ADFVd屬于類病毒，雖然在蘋果枝干和葉片上不引起癥狀，但對(duì)蘋果果實(shí)危害最大，ASSVd引起蘋果銹果病和花臉病，ADFVd引起蘋果凹果病，受危害的果實(shí)幾乎喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。二是發(fā)生率高。ACLSV和ASGV的發(fā)生率均高于60%，一些果園達(dá)100%，ASPV發(fā)生率一般在20%以上，相對(duì)較低;蘋果花葉病發(fā)生率近年來明顯增加，特別是一些新發(fā)展的蘋果生產(chǎn)區(qū)，發(fā)生率高于30%[5]。三是復(fù)合侵染普遍。經(jīng)檢測(cè)，兩種及更多種病毒復(fù)合侵染的發(fā)生率為60%～100%，病毒復(fù)合侵染通常產(chǎn)生協(xié)生作用，其危害比一種病毒單獨(dú)侵染更加嚴(yán)重，顯著降低樹勢(shì)和縮短盛果期[5]。四是蘋果花臉病、銹果病對(duì)我國蘋果產(chǎn)業(yè)造成重大危險(xiǎn)。近年來富士蘋果上發(fā)生的花臉病呈暴發(fā)趨勢(shì)，特別是山東和黃土高原產(chǎn)區(qū)，新樹結(jié)果后即表現(xiàn)果實(shí)花臉癥狀，調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)生率為8%～100%，對(duì)我國蘋果產(chǎn)業(yè)危害和風(fēng)險(xiǎn)最大;雖然蘋果凹果病目前僅在山東和新疆發(fā)現(xiàn)，但潛在危害不容忽視[5]。

2 蘋果病毒主要檢測(cè)方法

蘋果病毒檢測(cè)有多種方法，如指示植物法，電子顯微鏡技術(shù)，酶聯(lián)免疫技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)，以及近年來用于病毒鑒定的深度測(cè)序技術(shù)[9-11]。分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)病毒核酸來證實(shí)病毒的存在，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)快速，并可用于大量樣品的檢測(cè)，適用范圍廣。目前，常用的分子生物學(xué)技術(shù)包括核酸分子雜交技術(shù)、雙鏈RNA 電泳技術(shù)、RT-PCR技術(shù)等，其中RT-PCR 技術(shù)由于其準(zhǔn)確度高、操作性和實(shí)用性強(qiáng)，是目前適宜推廣的蘋果病毒檢測(cè)方法。

3 規(guī)范化的蘋果樣品采集和保存方法

不同生長期、不同組織中蘋果病毒的含量差別大，無論使用哪種檢測(cè)方法，都應(yīng)在適宜時(shí)間采集病毒含量相對(duì)高的樣品，并對(duì)樣品進(jìn)行恰當(dāng)保存和運(yùn)輸，以提高蘋果病毒檢測(cè)準(zhǔn)確度和檢測(cè)效率。

采樣時(shí)期：春季4、5月份，蘋果萌芽和新梢生長期是各種病毒從根部移動(dòng)到枝條并快速增殖的時(shí)期，此時(shí)樹體內(nèi)病毒含量高，是采集蘋果病毒檢測(cè)樣品的最佳時(shí)期。

組織類型和取樣方法：蘋果樹不同組織內(nèi)病毒含量不同，為提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，應(yīng)選取病毒含量高的組織進(jìn)行取樣。依據(jù)我們對(duì)多地多年蘋果樣品的選取和檢測(cè)，建議優(yōu)先選取的蘋果樣品為嫩芽、花、韌皮部組織和嫩葉。春季剪取生長旺盛的新梢或帶花的枝條，其他季節(jié)剪取兩年生15～20 cm長的枝條或帶有嫩葉的枝條用于剝?nèi)№g皮部組織。每株樣品標(biāo)記序號(hào)、品種、地點(diǎn)、采集人、采集時(shí)間等信息，裝入塑料袋密封。蘋果果皮中病毒含量高，也是一種常選擇的取樣組織。發(fā)育成熟的葉片及老熟葉片中病毒含量低，不建議采集。

取樣數(shù)量：取樣數(shù)量以檢測(cè)目的而定，用于育苗的采穗母本樹，應(yīng)逐一進(jìn)行單株取樣和檢測(cè);苗圃中的幼苗或幼樹建議按不小于1%或至少3株隨機(jī)取樣，并標(biāo)記取樣株。

樣品保存與運(yùn)輸：因離體組織中的核酸極易降解，應(yīng)盡快對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。樣品可在4～10℃下保存5～7 d。需長期保存時(shí)，將嫩芽、花、嫩葉、刮取的韌皮部組織直接用液氮速凍后置于-20℃冰箱保存1個(gè)月或置于-80℃冰箱保存半年。若需郵寄或長途運(yùn)輸時(shí)，嫩梢和枝條用濕潤的報(bào)紙或吸水紙包住，或者用保鮮膜完全裹住，放在塑料袋中密封保濕運(yùn)輸。收到樣品后應(yīng)立即開展檢測(cè)或進(jìn)行保存。

4 蘋果病毒的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

該技術(shù)包括蘋果樣品總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)、反轉(zhuǎn)錄、PCR和結(jié)果判別4個(gè)步驟。

4.1 蘋果病毒RT-PCR檢測(cè)方法使用的試劑與設(shè)備 ?試劑：dNTPs、Taq DNA、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、瓊脂糖、10×Loading Buffer、DNA Marker。

設(shè)備：水浴鍋、PCR儀、電泳儀及電泳槽、JY04S-3C型紫外凝膠成像儀。

4.2 蘋果樣品總RNA提取和質(zhì)量檢測(cè)

因蘋果組織中多酚、多糖含量高，常規(guī)TRIzol提取法不適用，推薦使用二氧化硅吸附法提取總RNA，具體方法見備注2。也可以使用常規(guī)的CTAB提取法，這里不做詳細(xì)介紹。

為保證檢測(cè)準(zhǔn)確度，應(yīng)對(duì)總RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)：利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA純度和濃度。OD260/OD280在1.8～2.2時(shí)，總RNA純度符合要求。濃度計(jì)算公式為 RNA（μg/mL）=OD260值×40。

4.3 反轉(zhuǎn)錄

通常采用隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以便用于檢測(cè)多種主要蘋果病毒。僅需檢測(cè)一種病毒時(shí)，可以使用特異性反向引物（表1）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體為：

在1.5 mL離心管中加入蘋果樣品總RNA 3.5 μL、隨機(jī)引物（10 μmol/L）0.5 μL、Oligo dT（10 μmol/L）0.5 μL、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）0.5 μL，加DEPC ddH2O 至20 μL，42℃反應(yīng)1 h，cDNA用于PCR或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4.4 PCR

鑒于蘋果病毒的復(fù)合侵染普遍，這里給出了常規(guī)PCR和多重PCR兩種方法。常規(guī)PCR適用于單獨(dú)對(duì)每種蘋果病毒進(jìn)行檢測(cè)，多重PCR檢測(cè)方法適用于同時(shí)檢測(cè)多種蘋果病毒。檢測(cè)引物見表1。鑒于ASSVd和ADFVd同屬于蘋果銹果類病毒屬Apscarviroid，可使用該屬的通用引物對(duì)apscarviroids-F和apscarviroids-R進(jìn)行檢測(cè)。PCR體系應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照（超純水）、陰性對(duì)照（健康或不帶病毒樣品）、陽性對(duì)照（帶有病毒的蘋果組織材料）和內(nèi)參對(duì)照。推薦使用蘋果EF-1α基因作為內(nèi)參（引物對(duì)EF-1α-F和EF-1α-R，詳見表1）。

常規(guī)PCR：選用表1中所列每種病毒的特異引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR。反應(yīng)體系包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2.0 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、正向引物（20 μmol/L）0.5 μL、反向引物（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，對(duì)應(yīng)引物適宜退火溫度（表1）復(fù)性45 s，72℃對(duì)應(yīng)延伸1 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

多重PCR：反應(yīng)體系為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、ACLSV-F（20 μmol/L）1.0 μL、ACLSV-R（20 μmol/L）1.0 μL、ASGV-F1（20 μmol/L）1.0 μL、ASGV-R1（20 μmol/L）1.0 μL、ASPV-F1（20 μmol/L）0.4 μL、ASPV-R1（20 μmol/L）0.4 μL、apscarviroids-F（20 μmol/L）0.5 μL、apscarviroids-R（20 μmol/L）0.5 μL、EF-1α-F（20 μmol/L）0.5 μL、EF-1α-R（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0. 5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，53℃復(fù)性45 s，68℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

4.5 檢測(cè)結(jié)果判別

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5～10 μL產(chǎn)物加入DNA上樣緩沖液，使用預(yù)先做好的1%～1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120～150 V電壓電泳約30 min，用0.5 μg/mL溴化乙錠或其他DNA染料染色10 min。在凝膠成像儀中利用紫外光觀察條帶位置，如果出現(xiàn)與陽性對(duì)照樣品擴(kuò)增的條帶位置相同的預(yù)期特異性條帶（片段大小參考表1），初步判斷為陽性樣品。如果需要進(jìn)一步確認(rèn)，則將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序或?qū)⒛繕?biāo)條帶切膠純化后測(cè)序。將測(cè)序獲得的序列在GenBank網(wǎng)站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行BLASTn比對(duì)，根據(jù)比對(duì)獲得的序列相似度最高的病毒確定是否為目標(biāo)病毒。如果未觀察到目標(biāo)條帶，與陰性對(duì)照樣品一樣，則說明樣品中不含有待檢病毒。

附錄

1.蘋果組織總RNA的二氧化硅吸附提取法[19]

操作步驟：

1） 用液氮預(yù)冷研缽，取約0.1 g植物組織（葉片、韌皮部或果皮）放于研缽中研磨，將研磨后的粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中。

2） 向離心管中加入1 mL研磨緩沖液和100 μL 2%偏重亞硫酸鈉，振蕩混勻。

3） 短暫離心，取800 μL勻漿轉(zhuǎn)入事先加入150 μL 10%十二烷基肌氨酸鈉的離心管中，70℃保溫10 min（中間顛倒混勻3～4次），冰上放置5 min，12 000 g離心10 min。

4） 取上清轉(zhuǎn)入含有150 μL無水乙醇、300 μL 6 mol/L碘化鈉、30 μL 10%二氧化硅懸浮液（pH 2.0）的離心管中，室溫振蕩20 min。

5） 6 000 r/min離心1 min，棄去上清，加入500 μL清洗緩沖液振蕩懸浮沉淀，6 000 r/min離心1 min。

6） 重復(fù)步驟（5）1至2次。

7） 將離心管反扣在紙巾上，用槍頭吸掉管中殘余的上清，室溫下自然干燥3～5 min，加入80 μL 無核酶的純水，振蕩懸浮，70℃保溫4 min。

8） 13 000 r/min 離心3 min，吸取上清60 μL，用于合成cDNA或保存-80℃。

試劑配制：

以下試劑均用無核酶的純水或焦磷酸二乙酯（DEPC）處理的ddH2O水進(jìn)行配制。

10%二氧化硅懸浮液：稱取SiO2微粒20 g于200 mL 無核酶的純水中，搖勻，沉淀一晝夜;倒掉上清，加水至200 mL，搖勻，沉淀5 h;倒掉176 mL上清，留下24 mL粉漿用鹽酸調(diào)節(jié)pH=2.0;高溫高壓滅菌后分裝于1.5 mL離心管，4℃保存。

2%偏重亞硫酸鈉：稱取偏重亞硫酸鈉1 g溶于50 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

10%十二烷基肌氨酸鈉：稱取十二烷基肌氨酸鈉5 g溶于50 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

6 mol/L碘化鈉：稱取90 g碘化鈉溶于100 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

研磨緩沖液：稱取（異）硫氰酸胍23.6 g，醋酸鈉（NaAC）0.82 g，EDTA 0.37 g，醋酸鉀（KAC）4.9 g，PVP-K30 1.25 g溶于50 mL水中，攪拌混勻，高溫高壓滅菌，冷卻后4℃保存，使用前加入適量2%偏重亞硫酸鈉。

清洗緩沖液：取Tris堿0.30 g溶于125 mL水，鹽酸調(diào)節(jié)pH=7.5，稱取0.04 g EDTA，0.73 g NaCl加入以上Tris-HCl中，加入無水乙醇125 mL，定容至250 mL，4℃保存。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）