大鼠心肌細胞的分離鑒定以及培養

孟憲玉 楊曉敏

【摘要】心肌細胞分離技術出現后，各國實驗室都對其進行了全面的研究分析，本文主要探求的是穩定的大鼠心肌細胞的分離鑒定以及培養技術。本文綜合國內外分離技術，最終采用酶消化法分離單個心肌細胞，并且利用相應的培養基進行培養，同時結合免疫熒光法對細胞進行鑒定，以判斷分離培養技術是否合理。

【關鍵詞】大鼠心肌細胞;分離鑒定技術;細胞培養方法;胰蛋白酶

【中圖分類號】R363 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.1..02

引言：大鼠心肌細胞的分離鑒定以及培養工作已經有五十多年的歷史，但是心肌細胞的分離、鑒定、培養上還存在一定的局限性。在這樣的情況下，加強對分離培養技術的探索，有效延長心肌細胞的生長、存活的時間，可以為心肌細胞的研究工作提供更好的研究樣本，為國家的基因研究做出貢獻。

1 試驗材料

為了保證得到的結果科學有效，試驗中選擇了某大學醫學院實驗動物中心提供的健康大鼠，同時準備了Sigma公司的I型膠原酶、胰蛋白酶、Na2ATP，MgATP、阿糖胞苷等分析材料。除此之外，還準備了無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液、細胞保存液，并且用NaOH將這些液體的pH調節值至7.38，為了保證細胞培養工作的順利進行，在試驗前還采用了GIBCO公司的優級胎牛血清（FCM）和DMEM/F12培養基等材料。

2 試驗方法

2.1 單個心肌細胞的分離

本文采用酶消化法分離單個心肌細胞，在進行心肌細胞分離的過程中，首先，要讓大鼠脫臼昏厥。朝大鼠腹腔內注射肝素500 U/kg，五分鐘后大鼠就會在肝素的作用下昏厥。其次，要取出大鼠心臟。用剪刀剪開大鼠胸腔后，讓心臟充分暴露出來，并且將心臟劍俠，放置在4℃的生理鹽水中清理。再次，要對大鼠心臟進行灌流。采用心臟離體灌流裝置，對心臟主動脈進行逆行插管并且縫線扎緊，同時用還要對其進行預熱，當溫度在37℃時，就可以正式進行主動脈逆行灌流。需要注意的是在這個環節中，要保證灌流速度在9～10 mL/min范圍內。逆行灌流的過程中，涉及無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液這三種液體，液體順序、時間各不相同，其中酶液最后灌注且灌注時間最長。最后，要完成保存處理。在完成灌流后，剪下心室保存在準備好的細胞保存液中并剪碎，需要注意的是，至少要靜置一小時后，才能夠應用到細胞實驗中，在一小時內，心室碎片在室溫下可以更好完成復鈣任務。

2.2 細胞記錄方法和形式

在室溫保存一個小時后，大鼠心室肌細胞就可以放置在正常勝利濃度鈣中，想要具體檢測耐鈣心室肌細胞個數，可以通過高倍或者低倍鏡，計算得到桿狀細胞總數以及球形細胞總數，然后利用桿狀細胞總數除以上述兩種細胞之和，就可以得到具體的個數數據。

2.3 心肌細胞的培養觀察

除了要對細胞進行分離的之外，還要對細胞進行培養觀察，最佳的傳代培養時間在細胞生長增殖至培養板的80%～90%這一階段。首先要將培養液吸去，利用無血清的細胞培養液對細胞進行沖洗，一般情況下要沖洗2～3次;其次要在每個孔內添加0.25%的胰蛋白酶200 μL，等待3～5分鐘，待細胞的完全消化吸收后，在進行下一階段的操作;再次在每個孔內加入20%的FBSDMEM/F12培養液，在這個過程中，要將細胞吹起并打勻，然后就可以按照1：2的比例進行傳代培養工作;最后，將得到細胞的放置在溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養箱內，培養24小時后，將20%的FBSDMEM/F12培養液更換為10%的FBSDMEM/F12培養液。經過上述處理后，就可以利用顯微鏡觀察大鼠心肌細胞的成長狀態和形態特征，需要注意的是在觀察的過程中，要實時測定大鼠心肌細胞的搏動次數。

2.4 心肌細胞的化學鑒定

本文以免疫組織化學鑒定過程為例，在實際鑒定過程中，一共分為四個環節，第一個環節，將大鼠心肌細胞分離、培養后得到的細胞放置在0.25%胰蛋白酶中，讓其消化、吹散;第二個環節，待細胞消化吹散后，將其移入6孔板中，并且在孔板內設置無菌蓋玻片，進而將溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養箱內;第三個環節，靜置48小時后，無菌蓋玻片上會長滿細胞，將蓋玻片去除放入平皿中，加入固定液，固定25分鐘后利用PBS反復沖洗3次，每次控制在3分鐘左右;第四個環節，按照順序，依次對無菌蓋玻片滴加科學設計的濃度配比的過氧化酶阻斷溶液、羊血清、ɑ-actin抗體、生物素標記羊抗小鼠抗體、鏈霉菌抗生物素、過氧化物酶溶液，每次滴加液體后，都要在室溫下孵育10分鐘，其中ɑ-actin抗體較為特殊，需要孵育60分鐘，最終加入新鮮配制的DAB顯色液并且完成封片后，就可以進行觀察[1]。

3 試驗結果

3.1 形態學觀察

按照具體的步驟完成試驗過程后，將得到大鼠心肌細胞倒置在顯微鏡下進行觀察，記錄不同時間節點下，大鼠心肌細胞的生長和形態狀態，結合大鼠心肌細胞的搏動次數，最終得到了不同培養時間后（8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、7～10天、40天、45天）在倒置相差顯微鏡下觀察原代培養心肌細胞。8小時后，細胞就會逐步的貼壁生長;24小時后，細胞均已貼壁，并且從圓形或卵圓形轉變扁平形、梭形，還有部分細胞會呈現出三角形，且頂部較為突出。48小時后，研究人員發現，細胞出現了自發性脈搏搏動，雖然整體搏動節律較為緩慢，但是搏動持續，每分鐘平均搏動8～10次;72小時后，細胞逐漸生長開，搏動也日益明顯，可以達到每分鐘60次，部分細胞會伸出偽足，形狀從扁平形、梭形、三角形，變為不規則星形，可能會出現多個、單個細胞核，但是單個細胞核的情況較多，細胞核為原型，核仁較為清晰;96小時后，大部分細胞都會生出偽足，且較為清晰民享，細胞搏動頻率更加明顯，的平均次數增加，絕大部分細胞都會變成不規則星形。120小時后，細胞形成細胞簇，細胞簇會出現同步搏動的情況。7～10天后，就可以開始傳代培養，每三天開展一次傳代培養，細胞逐漸成熟。40天～45天，開始逐漸出現細胞變性死亡的情況[2]。

3.2 檢測的結果

經過間接免疫熒光檢測以及免疫組織化學鑒定的情況來看，通過陰性對照結果來看，加入cTnT抗體的小鼠心肌細胞在胞膜和胞漿中均呈綠色熒光，也就是說，cTnT抗體呈陽性。同時根據免疫組織化學鑒定的情況來看，心肌細胞的分離培養在七天后，就進行了ɑ-actin抗體檢測，檢測結果呈陽性反應，肌原纖維較為清晰。綜合這兩種鑒定檢測結果可以得出，大鼠心肌細胞分離培養的過程中，生物特性不會發生改變，受到一些生長因子的影響，一些細胞在離體后可以存活40～120天，部分生長力較為旺盛的細胞可以持續培養1年左右。也就是說大鼠心肌細胞分離培養可以在細胞學、動物學、生物化學、免疫學中得到應用，還需要注意的是，因為本文采用的是酶消化法分離單個心肌細胞方法，除了這種分離培養方法之外，還有很多其他的方法，這些方法各具優缺，因此要根據實際需求，科學的選擇分離培養方式，比如：消化培養法在實際應用中，雖然操作便捷，但得到的細胞較少[3]。

總結：綜上所述，通過對大鼠心肌細胞分離培養鑒定研究，對大鼠的心肌細胞有了全面的了解，作為生物醫學實驗研究中最常使用的品種，在日后還需要進一步加強對其的研究分析工作。

參考文獻

[1] 付 微，劉 飛，喬陸明，張緒東.新生SD大鼠心肌細胞分離培養及純化的快速便捷方法及鑒定[J].牡丹江醫學院學報，2017，38（05）：6-8+5.

[2] 程 俊，曾曉榮，譚曉秋，等.一種改良的原代大鼠乳鼠心肌細胞分離及培養方法[J].四川生理科學雜志，2016，38（04）：187-189.

[3] 何 璐.大鼠心肌干細胞的分離培養與鑒定及鹿茸多肽對其分化的誘導作用研究[D].吉林大學，2016.

本文編輯：董 京