褪黑素MT2受體激動劑IIK-7對骨癌大鼠產生鎮痛作用

張龍新　王菁　周敏

【摘要】 目的：研究褪黑素MT2受體激動劑IIK-7對骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）大鼠機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的影響。方法：將30只180～220 g清潔級雌性SD大鼠隨機分為5組（n=6）：空白對照組（CONT組）、假手術組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）、IIK-7組及DMSO組。CONT組不做任何處理;Sham組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL PBS液，鞘內置管，術后第3天開始鞘內連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;BCP組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;IIK-7組大鼠左后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，術后第3天開始鞘內連續輸注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;DMSO組大鼠左側后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，術后第3天開始鞘內連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）。用Von Frey纖毛測痛儀測定術前及術后第7、14、21天各組大鼠左后肢MWT;X線拍攝檢測大鼠左后肢骨癌模型建立情況。結果：影像學結果顯示，骨癌痛大鼠（BCP組）術側脛骨骨皮質不連續，骨小梁缺失，周圍組織明顯腫脹。術前，各組大鼠術側后肢MWT比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;術后第7、14、21天，CONT組與Sham組術側后肢MWT較術前均無明顯變化（P>0.05），但BCP組大鼠術側后肢MWT均較CONT組明顯降低（P<0.05）;術后第7天，IIK-7組大鼠術側后肢MWT與BCP組比較，差異無統計學意義（P>0.05），術后第14、21天，IIK-7組大鼠術側后肢MWT較BCP組均明顯升高（P<0.05）。結論：褪黑素MT2受體激動劑IIK-7可以提高骨癌痛大鼠MWT，緩解骨癌大鼠的疼痛。

【關鍵詞】 骨癌疼痛 褪黑素MT2受體 IIK-7 機械縮足反射閾值

Analgesic Effect of Melatonin MT2 Receptor Agonist IIK-7 on Bone Cancer Rats/ZHANG Longxin， WANG Jing， ZHOU Min. //Medical Innovation of China， 2020， 17（15）： 00-013

[Abstract] Objective： To study the effects of melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 on mechanical withdrawal threshold （MWT） of bone cancer pain （BCP） rats. Method： Thirty 180-220 g clean female SD rats were randomly divided into 5 groups （n=6）： blank control group （CONT group）， sham operation group （Sham group）， bone cancer pain group （BCP group）， IIK-7 group， DMSO group. No treatment was performed in the CONT group; 10 μL PBS solution was injected into the tibia bone marrow cavity of the left hind limb of the rats in the Sham group， and a sheath was placed in the tube， continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） was started on the third day after surgery; 10 μL of Walker256 rat breast cancer cell PBS suspension was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rats left hind limb， and DMSO （1 μL/h， 10 h） was continuously infused; in the IIK-7 group， 10 μL of Walker256 was injected into the bone marrow cavity of the left hind limb of the rat， PBS suspension of rat breast cancer cells， continuous intrathecal infusion of IIK-7 （1 μL/h， 0.5 μg/μL， 10 h） started on the 3rd day after operation; 10 μL Walker256 was injected into the tibia of the left hind limb of the DMSO group rats PBS suspension of rat breast cancer cells， and continuous intrathecal infusion of DMSO （1 μL/h， 10 h） began on the 3rd day after surgery. MWT of left hind limb was measured by von Freys ciliary pain detector before operation and on the 7th， 14th and 21th day after operation， and the establishment of bone cancer model of left hind limb was detected by X-ray. Result： The imaging results showed that in BCP group， the tibial cortex was discontinuous， the trabecula was absent and the surrounding tissue was swollen. Before operation， there were no significant differences in MWT between the each groups （P>0.05）; on the 7th， 14th and 21st day after operation， MWT of the hind limbs in the CONT group and the Sham group had no significant changes （P>0.05）， but MWT of the hind limbs in the BCP group was significantly lower than that in the CONT group （P<0.05）. On the 7th day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group was not significantly different from that in BCP group （P>0.05）. On the 14th and 21st day after operation， MWT of hindlimb in IIK-7 group were significantly higher than those in BCP group （P<0.05）. Conclusion： Melatonin MT2 receptor agonist IIK-7 can improve MWT and relieve pain of bone cancer rats.

[Key words] Bone cancer pain Melatonin MT2 receptor IIK-7 Mechanical withdrawal threshold

First-authors address： Fujian Provincial Maternity and Childrens Hospital， Fuzhou 350001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.15.003

骨癌疼痛（bone cancer pain，BCP）是原發性骨癌或乳腺癌、前列腺癌、肺癌等轉移性骨癌患者最常見、最嚴重的并發癥之一，可能導致患者出現睡眠障礙、焦慮、抑郁及自殺傾向，嚴重影響患者的生活質量[1]。雖然有多種治療方法可以減輕骨癌疼痛，包括非甾體抗炎藥、雙膦酸鹽、放療和外科手術，但是阿片類藥物的使用仍然是主要的鎮痛措施。然而由于阿片類藥物的成癮性及耐受性限制了其在疼痛治療中的使用[2]。此外，現代生活方式和慢性病顯著增加了新病例的數量。因此探尋骨癌痛發病機制、優化骨癌痛治療成為亟待解決的問題。

已有研究表明，在臨床前模型中，MT及其受體激動劑對傷害性和神經病理性疼痛具有鎮痛作用，而一些用于治療睡眠障礙的MT激動劑具有良好的安全性和耐受性[3]。近年來，一些MT受體激動劑已被批準用于治療睡眠和抑郁癥，其他一些藥物也進入了臨床試驗，包括TIK-301等[4]。但是MT受體激動劑尚未被批準用于疼痛的治療。最近，Gobbi等[5]通過使用褪黑素MT2受體拮抗劑證明了MT的鎮痛特性是由褪黑素MT2受體特異性介導的。且有研究顯示褪黑素MT2受體激動劑IIK-7對神經病理性疼痛有鎮痛作用[6]，但其是否可以通過相似的機制治療骨癌痛尚不清楚，有待進一步研究。為此筆者進行以下探究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 （1）實驗動物：選取清潔級健康清潔級雌性SD大鼠30只（180～220 g），吳氏實驗動物有限公司采購，于20～25 ℃溫度、（50±5）%空氣濕度中飼養，可自由飲水攝食，并設置明暗生活環境各12 h。（2）主要儀器及試劑：超凈臺（美國Biological）、恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）、無菌離心管、無菌凍存管（福州市康諾生物技術有限公司）、離心機（德國Eppendorf公司）、顯微鏡（Olypus日本）、Von Frey纖毛測痛儀、鞘內藥物輸注泵（上海玉研科學儀器有限公司）、無菌手術器械、微量進樣器（上海醫療器械廠）、一次性注射器、無菌紗布、棉球、4-0可吸收線、骨蠟、紅霉素眼膏、青霉素鈉注射液、水合氯醛、碘伏（福建省婦幼保健院）、Walker256大鼠乳腺癌細胞（上海久志生物科技有限公司）、PE管、胰酶、1640培養基、DMSO、IIK-7（福州市康諾生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 骨癌痛大鼠模型的建立及分組 大鼠稱重后向其腹腔內注射0.6 mL/100 g 10%水合氯醛麻醉，后固定在T型臺上;以大鼠角膜反射消失且其腳趾對鑷子鉗夾無反應評判達到滿意的麻醉深度。使用75%酒精消毒左后肢皮膚;用手術刀在脛骨平臺皮膚處切開約1 cm切口，用無齒鑷分離肌肉，小紗球止血，清晰分離脛骨骨膜暴露骨面;用4.5號無菌注射針頭在脛骨平臺上垂直鉆一小孔，拔出針頭，將一5.5號無菌注射針頭輕微彎曲，從小孔刺入脛骨骨髓腔，以測試骨髓腔的通暢情況;骨髓腔通暢后，用25 μL微量進樣器抽取10 μL Walker256大鼠癌細胞PBS混懸液緩慢注入骨髓腔，當液體反流時，緩慢拔出微量進樣器，立即用骨蠟封閉穿刺孔，穿刺孔周圍的癌細胞用無菌紗布擦除;并用蘸取75%酒精紗布擦拭手術切口以殺死遺留在骨髓腔外的癌細胞，之后逐層消毒縫合手術切口;接著稀釋8萬單位青霉素注射入大鼠腹腔內，切口處涂適量紅霉素軟膏以預防手術部位感染;最后將大鼠放在37 ℃熱板上復蘇后放入籠中繼續按原來的條件飼養。將30只大鼠隨機分為5組，每組6只：（1）空白對照組（CONT組）不做任何處理;（2）假手術組（Sham組）大鼠左側后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL PBS液，鞘內置管，術后第3天開始鞘內連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;（3）骨癌痛組（BCP組）大鼠左側后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）;（4）IIK-7組大鼠左側后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，術后第3天開始鞘內連續輸注IIK-7（1 μL/h，0.5 μg/μL，10 h）;（5）DMSO組大鼠左側后肢脛骨骨髓腔內注射10 μL Walker256大鼠乳腺癌細胞PBS混懸液，術后第3天開始鞘內連續輸注DMSO（1 μL/h，10 h）。

1.2.2 鞘內置管 10%水合氯醛麻醉大鼠，依據大鼠身體長度，剪一段PE-10導管（20～23 cm），并用微量進樣器將導管內注滿生理鹽水，將PE管送入插管的12號針頭內，在針頭后3 cm處做標記，再將PE管全部送入針頭;將麻醉的大鼠用剃毛機剔除大鼠頸部及腰骶部毛發，切開皮膚暴露手術視野并用碘伏無菌消毒;摸到骼脊部位，在兩骼脊連線中點處切開筋膜、肌肉，將導針緊貼脊柱旁開45°～60°角，傾斜向上30°角方向旋轉進針，有落空感時停止進針，可見大鼠尾部輕微擺動;用鑷子將PE管向脊髓上方緩慢推送至標記的3 cm處，小心旋轉拔出導針，留置PE管，打結并固定于進針肌肉處;將灌胃針從頸部經皮下送至插管處，將PE管經灌胃針送至頸部，在頸部打結并固定;將頸部及腰骶部皮膚縫合。若PE管內有血液，注射10 μL人工腦脊液并用打火機封口;無血液則可直接封口。術后將動物放回清潔籠內，大鼠單籠飼養，連續3 d，每天腹腔注射青霉素防止感染。

1.2.3 機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測定 準備好Von Frey測痛纖毛，分別為0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g，將待檢測大鼠放進檢測箱中（26 cm×14 cm×26 cm）適應30 min，待小鼠安靜后，依次用標準化的Von Frey測痛纖毛（0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g）垂直刺激大鼠左后肢足底中部，直至纖毛呈90°彎曲，觀察大鼠縮足反應。每只大鼠接受5次同一克數纖毛刺激，每次刺激間隔2 min。若大鼠出現3次或3次以上縮足反應，則記該纖毛克數作為該大鼠的機械痛閾。

1.2.4 影像學檢查 麻醉方法同建立骨癌痛模型時的麻醉方法，將大鼠固定在T型臺上，用X射線（50KVP）拍攝大鼠左后肢，觀察其脛骨中癌細胞的生長情況及脛骨被破壞的情況，拍攝完畢將大鼠放在37 ℃熱板上復溫，蘇醒后將其送回籠中繼續飼養。

1.3 觀察指標 觀察術前及術后第7、14、21天大鼠左后肢MWT;拍攝X線片，觀察術后第21天大鼠左后肢骨被侵襲情況。

1.4 統計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 X線檢查結果 正常大鼠（CONT組）骨小梁完整，骨皮質連續;骨癌痛大鼠（BCP組）術側脛骨骨皮質不連續，骨小梁缺失，周圍組織明顯腫脹。見圖1。

2.2 骨癌對大鼠MWT的影響 術前測定各組大鼠術側后肢MWT基礎值均相近，比較差異均無統計學意義（P>0.05）;術后第7、14、21天，CONT組與Sham組術側后肢MWT較術前均無明顯變化（P>0.05），但BCP組大鼠術側后肢MWT均較CONT組明顯降低（P<0.05）。見圖2和表1。

2.3 IIK-7對骨癌痛大鼠MWT的影響 術前測定各組大鼠術側后肢MWT基礎值均相近，比較差異均無統計學意義（P>0.05）;術后第7天，IIK-7組大鼠術側后肢MWT與BCP組比較差異無統計學意義（P>0.05），術后第14、21天，IIK-7組大鼠術側后肢MWT較BCP組均明顯升高（P<0.05）。見圖3、表2。

3 討論

目前，癌癥發病率越來越高，其中肺癌、乳腺癌、前列腺癌等很容易發生骨轉移，引起劇烈的骨癌痛。目前阿片類藥物是臨床上治療骨癌痛的常用藥物，但是由于成癮性、耐受性及嚴重不良反應等限制了其在骨癌痛中的應用。

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺），在調節睡眠覺醒周期、抑制腫瘤進展、改善免疫系統功能、控制機體各組織的穩態等生理過程中發揮重要作用[7]。然而，研究發現，褪黑素及其受體激動劑在控制慢性疼痛方面有很強的潛力[8]。IIK-7是MT的一個四環類似物，專門與MT受體結合，這種激動劑對MT2受體亞型的選擇性是MT1的90倍，對MT2受體亞型的親和力是MT的6倍[6]。IIK-7和MT一樣可以是促進睡眠和保護細胞免受電磁壓力[9]。

有研究顯示IIK-7可以提高神經病理性疼痛大鼠的MWT，但是其對骨癌痛的影響尚不清楚[4]。本實驗中通過大鼠脛骨骨髓腔內注射Walker256大鼠乳腺癌細胞建立大鼠脛骨癌痛模型，鞘內輸注IIK-7，觀察其對骨癌痛大鼠機械痛閾的影響。實驗觀察到骨癌痛組大鼠術側脛骨骨皮質不連續，骨小梁疏松，且建模后第7天開始，術側后肢MWT顯著降低，說明骨癌痛模型建立成功。建模后第14、21天，IIK-7組大鼠MWT均較BCP組明顯升高（P<0.05），說明IIK-7對骨癌痛有一定的緩解作用。

此外，褪黑激素具有抗氧化和抑癌作用[10]。一些證據顯示褪黑激素對多種類型的腫瘤有抑制作用，包括乳腺、子宮內膜、前列腺、卵巢、腸道和肝臟腫瘤等[11]。有研究顯示骨代謝與褪黑激素水平相關，褪黑激素對骨連接細胞增殖有影響[12-13]。

有研究表明，在特定時間點，褪黑激素水平較低，且與骨肉瘤的高發有關，猜測褪黑激素可能會對骨肉瘤細胞有抑制作用[11]。多項研究顯示褪黑激素對MG-63骨肉瘤細胞的抗增殖作用，并報道褪黑激素的抑制活性與絲裂原激活激酶和AKT信號通路有關。褪黑激素通過調節多種信號通路干擾骨肉瘤細胞的增殖[8]。褪黑激素特異性抑制ERK1/2的磷酸化激活，還表明褪黑激素的抑制功能與細胞周期蛋白CDK4和D1以及細胞周期蛋白CDK1和B1的下調有關[14]。因此褪黑素受體激動劑在緩解骨癌痛的同時是否有抑制骨癌發展的作用值得進一步研究。

有研究顯示IIK-7是通過活性氧而抑制神經病理性疼痛[16]。活性氧（ROS）是正常代謝過程中產生的天然副產物，在細胞信號轉導和體內平衡中起重要作用[15]。ROS種類很多，包括羥基自由基、超氧自由基、一氧化氮、過氧化氫和過氧亞硝酸鹽[16]。正常情況下，ROS產生受到抗氧化防御系統的嚴格調控[17]。ROS參與炎癥性疼痛和神經性疼痛的發病機制已被多次報道[18]，此外，ROS清除劑、超氧化物歧化酶（SOD）模擬化合物和抗氧化劑已被證明在嚙齒動物疼痛模型中具有顯著的鎮痛作用[19]。有研究顯示ROS清除劑能改善骨癌痛大鼠的機械痛[20]，但是IIK-7是否是通過ROS影響骨癌痛大鼠尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，褪黑素MT2受體激動劑IIK-7可以提高骨癌大鼠機械縮足反射閾值，對骨癌痛大鼠產生鎮痛作用，但是其潛在的機制以及其是否能抑制骨癌發展尚不清楚，值得進一步研究。

參考文獻

[14] Liu L，Xu Y，Reiter R J，et al.Inhibition of ERK1/2 Signaling Pathway is Involved in Melatonins Antiproliferative Effect on Human MG-63 Osteosarcoma Cells[J].Cell Physiol Biochem，2016，39（6）：2297-2307.

[15] Moris D，Spartalis M，Tzatzaki E，et al.The role of reactive oxygen species in myocardial redox signaling and regulation[J].Ann Transl Med，2017，5（16）：324.

[16] Xu J，Wei X，Gao F，et al.NADPH oxidase 2 derived ROS contributes to LTP of C-fiber evoked field potentials in spinal dorsal horn and persistent mirror-image pain following high frequency stimulus of the sciatic nerve[J].Pain，2019.

[17] Zhou T，Chuang C C，Zuo L.Molecular Characterization of Reactive Oxygen Species in Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury[J].Biomed Res Int，2015，2015：864946.

[18] Li Y，Li H，Han J，Sphingosine-1-phosphate receptor 2 modulates pain sensitivity by suppressing the ROS-RUNX3 pathway in a rat model of neuropathy[J].J Cell Physiol，2020，235（4）：3864-3873.

[19] Yu X，Chen C，Ke Q，et al.EGb761 Ameliorates Neuropathic Pain by Scavenging Reactive Oxygen Species[J].Pharmacology，2015，95（5-6）：293-299.

[20] Zhou Y Q，Liu D Q，Chen S P，et al.Reactive oxygen species scavengers ameliorate mechanical allodynia in a rat model of cancer-induced bone pain[J].Redox Biol，2018，14：391-397.

（收稿日期：2020-03-12） （本文編輯：董悅）