菲律賓蛤仔蛋白酶解物的抗氧化活性研究

穆姣姣 趙前程 崔相勇 李建偉 李智博

摘 要：本文研究了5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液的抗氧化活性，結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶兩種酶組合的酶解方式抗氧化活性最高，其羥自由基和[DPPH·]自由基清除率分別為（73.08±1.17）%和（35.18±1.10）%;進(jìn)一步對(duì)該雙酶酶解方式進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到最優(yōu)酶解工藝條件為：底物濃度1∶3、加酶量1%、酶解時(shí)間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液DPPH自由基清除率為42.68±2.90%。

關(guān)鍵詞：菲律賓蛤仔;抗氧化活性;酶解;風(fēng)味;工藝優(yōu)化

Abstract：Reseaching the enzymatic method of Ruditapes philippinarum protein showed that the DPPH radicals and hydroxyl radicals scavenging rate of Ruditapes philippinarum protein hydrolysates （by Flavourzyme and Protamex） were 73.08±1.17% and 35.18±1.10%. the hydrolysis conditions of the double-enzyme methods were optimized， and the optimal conditions were as follow： substrate concentration was 1：3， enzyme amount was 1%， time was 4 h. Under this condition， the DPPH radicals scavenging rate was 42.68±2.90%.

Key words：Ruditapes philippinarum; Antioxidant activity; Enzymolysis; Flavor; Process optimization

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）俗稱(chēng)蜆子，其生長(zhǎng)迅速，養(yǎng)殖方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短、投資少、收益大是灘涂貝類(lèi)養(yǎng)殖的重要品種之一，且其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味鮮美，與縊蟶、泥蚶和牡蠣有四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之稱(chēng)[1-3]。我國(guó)對(duì)菲律賓蛤仔除直接食用外，多是通過(guò)簡(jiǎn)單加工進(jìn)入食品市場(chǎng)，產(chǎn)品附加值低，其產(chǎn)品內(nèi)在價(jià)值沒(méi)有被充分有效地利用。如果能從高產(chǎn)量的菲律賓蛤仔及其加工下腳料中，通過(guò)酶解等生物手段，從中分離出一些具有抗氧化性質(zhì)的活性物質(zhì)，將這種活性物質(zhì)添加到食品中作為一種天然抗氧化劑或具有抗氧化功能的調(diào)味料產(chǎn)品，這將是充分利用菲律賓蛤仔蛋白的一條捷徑，將更充分有效地利用蛤類(lèi)產(chǎn)品本身價(jià)值，提高菲律賓蛤仔的附加值，進(jìn)而促進(jìn)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

菲律賓蛤仔、復(fù)合蛋白酶、堿性內(nèi)切酶、風(fēng)味蛋白酶、硫代巴比妥酸、DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基）、抗壞血酸、脫氧核糖。

1.2 菲律賓蛤仔酶解液的制備[4-6]

將菲律賓蛤仔攪碎后加入去離子水（1∶2，w/v），對(duì)菲律賓蛤仔以5種方式進(jìn)行酶解，見(jiàn)表1：復(fù)合蛋白酶（P）;堿性內(nèi)切酶（A）;風(fēng)味蛋白酶（F）;復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合（PF）：先用復(fù)合蛋白酶（P）酶解4 h，然后采用風(fēng)味蛋白酶（F）對(duì)酶解液繼續(xù)進(jìn)行酶解;堿性內(nèi)切酶與風(fēng)味蛋白酶組合（AF）：先用堿性內(nèi)切酶（A）酶解2 h，然后采用風(fēng)味蛋白酶（F）對(duì)酶解液繼續(xù)進(jìn)行酶解。五種方式酶解后，沸水浴100 ℃滅活10 min，8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，過(guò)濾。以未酶解的蛤蛋白溶液作為空白對(duì)照。

1.3 清除[DPPH·]自由基活性測(cè)定[7]

配制不同濃度的菲律賓蛤仔蛋白酶解液，取0.1 mL待測(cè)樣品，加入DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液3.9 mL，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，在515 nm下測(cè)定各溶液的吸光度值。用0.025 mg·mL-1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由曲線計(jì)算出[DPPH·]清除率為50%時(shí)菲律賓蛤仔酶解液的濃度，即為[DPPH·]自由基半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 清除羥自由基活性測(cè)定[4]

于試管中加入脫氧核糖溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、磷酸鈉緩沖液1 mL（pH 7.4，0.2 mol·L-1）、硫酸亞鐵-EDTA溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、樣品溶液0.4 mL和蒸餾水2 mL，然后繼續(xù)加入過(guò)氧化氫0.2 mL（10 mmol·L-1）啟動(dòng)反應(yīng)。將試管置于37 ℃水浴中1 h，然后加入三氯乙酸1 mL（2.8%）和硫代巴比妥酸1 mL（1%），于沸水浴中放置10 min，取出后立即放入冰浴中5 min。然后在532 nm下測(cè)定吸光度。計(jì)算出半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 酶解條件單因素試驗(yàn)

其他酶解條件不變，分別改變酶解時(shí)間（1、2、3、4 h和5 h）、底物濃度（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）和加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%）測(cè)定菲律賓蛤仔酶解液的抗氧化活性。

1.6 正交試驗(yàn)

以DPPH自由基清除率作為抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)酶解時(shí)間、加酶量和底物濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)，三因素三水平設(shè)計(jì)如表2所示。

2.1 菲律賓蛤仔5種酶解液的抗氧化活性比較分析

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液及空白對(duì)照的抗氧化活性如表3所示，酶解液的抗氧化活性顯著（p<0.05）高于空白對(duì)照;復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合方式制備的酶解液羥自由基和[DPPH·]自由基清除率顯著高于其他方式的酶解液（p<0.05），分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;通過(guò)對(duì)復(fù)合蛋白酶制備的蛋白酶解物再進(jìn)一步采用風(fēng)味蛋白酶處理，不僅提高了風(fēng)味，而且[DPPH·]自由基清除活性顯著增強(qiáng)。

2.2 菲律賓蛤仔酶解工藝優(yōu)化

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液經(jīng)過(guò)自由基清除率比較，復(fù)合蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶的自由基清除率及風(fēng)味最好，因此，對(duì)此種酶解方式制備的蛤蛋白酶解物進(jìn)行工藝優(yōu)化。考慮到雙酶組合的酶解過(guò)程中，酶解液的自由基清除率是由復(fù)合蛋白酶起主要作用，因此，對(duì)雙酶組合中的復(fù)合蛋白酶酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖1知，酶解時(shí)間為3 h，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，酶解時(shí)間選擇3 h。

2.2.2 底物濃度對(duì)菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖2知，底物濃度為1∶3時(shí)，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，最佳底物濃度選擇1∶3。

2.2.3 加酶量對(duì)菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖3知，當(dāng)加酶量為0.8%時(shí)，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，加酶量選擇0.8%。

2.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，確立了最佳復(fù)合蛋白酶酶解條件，在此基礎(chǔ)上，以[DPPH·]自由基清除率為指標(biāo)，對(duì)酶解時(shí)間、底物濃度和加酶量進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4知，[DPPH·]自由基清除率的影響因素為酶解由大到小依次為酶解時(shí)間、底物濃度和加酶量。由k值得最佳組合為A2B3C3，即酶解時(shí)間4 h，底物濃度1∶3，加酶量1%，在此條件下，[DPPH·]自由基清除率是（42.68±2.90）%。

3 結(jié)論

酶解方式對(duì)菲律賓蛤仔蛋白酶解物抗氧化活性有明顯的影響。復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶組合雙酶酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解物的[DPPH·]自由基和羥自由基清除率分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;最優(yōu)酶解工藝條件為：底物濃度1∶3，加酶量1%，酶解時(shí)間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液[DPPH·]自由基清除率為（42.68±2.90）%。

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