菲律賓蛤仔蛋白酶解物的抗氧化活性研究

穆姣姣 趙前程 崔相勇 李建偉 李智博

摘 要：本文研究了5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液的抗氧化活性，結果表明風味蛋白酶和復合蛋白酶兩種酶組合的酶解方式抗氧化活性最高，其羥自由基和[DPPH·]自由基清除率分別為（73.08±1.17）%和（35.18±1.10）%;進一步對該雙酶酶解方式進行工藝優化，得到最優酶解工藝條件為：底物濃度1∶3、加酶量1%、酶解時間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液DPPH自由基清除率為42.68±2.90%。

關鍵詞：菲律賓蛤仔;抗氧化活性;酶解;風味;工藝優化

Abstract：Reseaching the enzymatic method of Ruditapes philippinarum protein showed that the DPPH radicals and hydroxyl radicals scavenging rate of Ruditapes philippinarum protein hydrolysates （by Flavourzyme and Protamex） were 73.08±1.17% and 35.18±1.10%. the hydrolysis conditions of the double-enzyme methods were optimized， and the optimal conditions were as follow： substrate concentration was 1：3， enzyme amount was 1%， time was 4 h. Under this condition， the DPPH radicals scavenging rate was 42.68±2.90%.

Key words：Ruditapes philippinarum; Antioxidant activity; Enzymolysis; Flavor; Process optimization

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）俗稱蜆子，其生長迅速，養殖方法簡單，生產周期短、投資少、收益大是灘涂貝類養殖的重要品種之一，且其營養豐富、肉味鮮美，與縊蟶、泥蚶和牡蠣有四大養殖貝類之稱[1-3]。我國對菲律賓蛤仔除直接食用外，多是通過簡單加工進入食品市場，產品附加值低，其產品內在價值沒有被充分有效地利用。如果能從高產量的菲律賓蛤仔及其加工下腳料中，通過酶解等生物手段，從中分離出一些具有抗氧化性質的活性物質，將這種活性物質添加到食品中作為一種天然抗氧化劑或具有抗氧化功能的調味料產品，這將是充分利用菲律賓蛤仔蛋白的一條捷徑，將更充分有效地利用蛤類產品本身價值，提高菲律賓蛤仔的附加值，進而促進我國經濟發展。

1 材料與方法

1.1 材料

菲律賓蛤仔、復合蛋白酶、堿性內切酶、風味蛋白酶、硫代巴比妥酸、DPPH（2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基）、抗壞血酸、脫氧核糖。

1.2 菲律賓蛤仔酶解液的制備[4-6]

將菲律賓蛤仔攪碎后加入去離子水（1∶2，w/v），對菲律賓蛤仔以5種方式進行酶解，見表1：復合蛋白酶（P）;堿性內切酶（A）;風味蛋白酶（F）;復合蛋白酶與風味蛋白酶組合（PF）：先用復合蛋白酶（P）酶解4 h，然后采用風味蛋白酶（F）對酶解液繼續進行酶解;堿性內切酶與風味蛋白酶組合（AF）：先用堿性內切酶（A）酶解2 h，然后采用風味蛋白酶（F）對酶解液繼續進行酶解。五種方式酶解后，沸水浴100 ℃滅活10 min，8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，過濾。以未酶解的蛤蛋白溶液作為空白對照。

1.3 清除[DPPH·]自由基活性測定[7]

配制不同濃度的菲律賓蛤仔蛋白酶解液，取0.1 mL待測樣品，加入DPPH標準溶液3.9 mL，當反應達到穩態后，在515 nm下測定各溶液的吸光度值。用0.025 mg·mL-1 DPPH標準溶液做標準曲線，由曲線計算出[DPPH·]清除率為50%時菲律賓蛤仔酶解液的濃度，即為[DPPH·]自由基半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽性對照。

1.4 清除羥自由基活性測定[4]

于試管中加入脫氧核糖溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、磷酸鈉緩沖液1 mL（pH 7.4，0.2 mol·L-1）、硫酸亞鐵-EDTA溶液0.2 mL（10 mmol·L-1）、樣品溶液0.4 mL和蒸餾水2 mL，然后繼續加入過氧化氫0.2 mL（10 mmol·L-1）啟動反應。將試管置于37 ℃水浴中1 h，然后加入三氯乙酸1 mL（2.8%）和硫代巴比妥酸1 mL（1%），于沸水浴中放置10 min，取出后立即放入冰浴中5 min。然后在532 nm下測定吸光度。計算出半抑制率EC50。以抗壞血酸做為陽性對照。

1.5 酶解條件單因素試驗

其他酶解條件不變，分別改變酶解時間（1、2、3、4 h和5 h）、底物濃度（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5）和加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%）測定菲律賓蛤仔酶解液的抗氧化活性。

1.6 正交試驗

以DPPH自由基清除率作為抗氧化活性評價指標，根據酶解條件單因素實驗結果，對酶解時間、加酶量和底物濃度進行正交試驗，三因素三水平設計如表2所示。

2.1 菲律賓蛤仔5種酶解液的抗氧化活性比較分析

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液及空白對照的抗氧化活性如表3所示，酶解液的抗氧化活性顯著（p<0.05）高于空白對照;復合蛋白酶與風味蛋白酶組合方式制備的酶解液羥自由基和[DPPH·]自由基清除率顯著高于其他方式的酶解液（p<0.05），分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;通過對復合蛋白酶制備的蛋白酶解物再進一步采用風味蛋白酶處理，不僅提高了風味，而且[DPPH·]自由基清除活性顯著增強。

2.2 菲律賓蛤仔酶解工藝優化

5種酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解液經過自由基清除率比較，復合蛋白酶+風味蛋白酶的自由基清除率及風味最好，因此，對此種酶解方式制備的蛤蛋白酶解物進行工藝優化。考慮到雙酶組合的酶解過程中，酶解液的自由基清除率是由復合蛋白酶起主要作用，因此，對雙酶組合中的復合蛋白酶酶解工藝條件進行優化。

2.2.1 酶解時間對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖1知，酶解時間為3 h，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，酶解時間選擇3 h。

2.2.2 底物濃度對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖2知，底物濃度為1∶3時，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，最佳底物濃度選擇1∶3。

2.2.3 加酶量對菲律賓蛤仔蛋白酶解液抗氧化活性的影響

由圖3知，當加酶量為0.8%時，[DPPH·]自由基清除率最高，因此，加酶量選擇0.8%。

2.2.4 正交試驗

根據單因素試驗，確立了最佳復合蛋白酶酶解條件，在此基礎上，以[DPPH·]自由基清除率為指標，對酶解時間、底物濃度和加酶量進行三因素三水平正交試驗，結果見表4。由表4知，[DPPH·]自由基清除率的影響因素為酶解由大到小依次為酶解時間、底物濃度和加酶量。由k值得最佳組合為A2B3C3，即酶解時間4 h，底物濃度1∶3，加酶量1%，在此條件下，[DPPH·]自由基清除率是（42.68±2.90）%。

3 結論

酶解方式對菲律賓蛤仔蛋白酶解物抗氧化活性有明顯的影響。復合蛋白酶與風味蛋白酶組合雙酶酶解方式制備的菲律賓蛤仔蛋白酶解物的[DPPH·]自由基和羥自由基清除率分別為（35.18±1.10）%和（73.08±1.17）%;最優酶解工藝條件為：底物濃度1∶3，加酶量1%，酶解時間4 h，在此條件下，蛤蛋白酶解液[DPPH·]自由基清除率為（42.68±2.90）%。

參考文獻：

[1]張榭令，姜仕臣，叢裕泉，等.山東蓬萊菲律賓蛤仔資源調查研究[J].海洋湖沼通報，2007（4）：151-156.

[2]杜尚昆，邊永德，柳中鋒.菲律賓蛤仔工廠化育苗技術[J].漁業現代化，2005（3）：24-25.

[3]陶 平，許慶陵，譚淑榮.大連沿海幾種腹足類和雙殼類的營養成分分析[J].遼寧師范大學學報（自然科學版），2000（2）：182-186.

[4]Dong S Y，Zeng M Y，Wang D F，et al.Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from Silver carp （Hypophthalmichthys molitrix）[J].Food Chemistry，2007，107（4）：1485-1493.

[5]Tsai J S，Chen J L，Pan B S.ACE-inhibitory peptides identified from the muscle protein hydrolysate of hard clam （Meretrix lusoria）[J].Process Biochemistry，2008，43（7）：743-747.

[6]Tsai J S，Lin T C，Chen J L，et al.The inhibitory effects of freshwater clam （Corbicula fluminea， Muller） muscle protein hydrolysates on angiotensin I converting enzyme[J].Process Biochemistry，2006，41：2276-2281.

[7]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity[J].LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.