HPLC-MS/MS法測定人尿液中納洛酮、6-單乙酰嗎啡的含量

摘 要：目的：通過對海洛因代謝物6-單乙酰嗎啡及阿片類治療藥劑納洛酮的色譜過程的篩選，分離兩種物質且其線性、重復性、回收率滿足要求。方法：利用液相色譜-串聯質譜法，選擇不同的色譜柱、色譜條件、前處理方法等，最后選出合適的條件對納洛酮和6-單乙酰嗎啡進行分離。結果：人尿液中納洛酮與6-單乙酰嗎啡可以得到有效分離。結論：HPLC-MS/MS法測定人血液中納洛酮和6-單乙酰嗎啡的含量，在2.5ng/mL-40ng/mL范圍內的線性>0.995，組內偏差<10%，回收率為85%-98%

關鍵詞：液質聯用;納洛酮;單乙酰嗎啡;尿液

海洛因是國家禁止的第一代毒品，其在體內代謝成6-單乙酰嗎啡作為吸食海洛因的標志物。然而在對阿片類中毒的患者治療時，常常會使用納洛酮作為解毒劑和治療劑進行沖擊治療。納洛酮和6-單乙酰嗎啡是同分異構體，且結構接近。為排除干擾，本文通過對色譜條件，離子對的選擇等方面進行試驗和優化。

1 實驗條件

1.1 設備與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津），API4000三重四級桿質譜儀（AB SCIEX），湘儀高速離心機（HT16MM），BRAND移液器，純水器（Millipore）。

6-單乙酰嗎啡（批號：FE12131602，Cerilliant，含量1.018mg/mL），

納洛酮（批號：FN05311602，Cerilliant，含量1.000mg/mL）

內標（批號：FE07061501，Cerilliant）

甲醇為色譜純（Merk），甲酸為質譜級（Fisher），超純水為自制的。

1.2 色譜柱

Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm×5μm）

Agilent XDB-C18（150mm×2.6mm×3.5μm）

1.3 質譜條件

質譜條件：質譜離子化方式為ESI+。

海洛因在人體內特征代謝產物6-單乙酰嗎啡結構和納洛酮的結構如下：

納洛酮 6-單乙酰嗎啡

單乙酰嗎啡與納洛酮的分子式均為：C19H21NO4，分子量均為327.37。利用LC-MS/MS進行方法優化過程中找到的特征離子對如下：

由上表看出，兩種物質在相同質譜條件下，其碎片離子有較大的交疊區間。且通過觀察，兩種物質的DP能接近，且均非突變型DP變化，趨向性不明顯。在同一條件下，其碎片離子會互相干擾。這也在后續的試驗中得到證明。最后，選擇的特征離子對如下：

在色譜柱選擇時，首先采用通用的安捷倫XDB-C18發現目標物的峰型較差，且由于結構相似，兩種物質較難進行分離。故而根據目標物的多環結構選擇PFP五氟苯基柱，對類似的多環結構進行分離。

2 樣品制備

2.1 空白樣品

選取小牛血清1mL，加入10μL的地西泮--D5內標（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸鈉緩沖液，混勻后加入3mL乙醚進行萃取。取乙醚層1.5mL水浴揮干（60℃）后加復溶液100μL溶解進樣。

2.2 質控樣品

選取小牛血清0.9mL，加入0.1mL已知濃度的標準目標物溶液，10μL的地西泮--D5內標（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸鈉緩沖液，混勻后加入3mL乙醚進行萃取。取乙醚層1.5mL水浴揮干（60℃）后加復溶液100μL溶解進樣。

2.3 樣品

用移液器移取血液樣本1mL，加入10μL的地西泮-D5內標（1μg/mL），2mLpH9.2硼酸鈉緩沖液，混勻后加入3mL乙醚進行萃取。取乙醚層1.5mL水浴揮干（60℃）后加復溶液100μL溶解進樣。

將經調pH、渦旋萃取、富集復溶后，導入液相色譜--串聯質譜聯用儀中，利用母離子/定量離子對（237.0/ 194.1）響應值的峰面積與內標地西泮-D5的峰面積比，隨其含量的增加成正比，與標準系列比較來進行定量分析。

3 參數調試

通過測試表明：當流速處于0.25mL/min-0.4mL/min時納洛酮與單乙酰嗎啡的分離效果不理想，單乙酰嗎啡中存在未分離出的納洛酮峰，納洛酮中同樣含有單乙酰嗎啡的峰。最后會對判定結果造成干擾，導致假陽性或者假陰性的產生。當流速處于0.2mL/min時，兩個色譜峰可以較完整的分離開，且內部包含的雜質目標峰可以分離。（見下圖）。由實驗測試結果確認色譜條件為：色譜柱：選用五氟苯基柱;流動相：72%乙腈的甲酸--乙酸銨水溶液（20mmol）。流速：0.2mL/min，進樣體積為10μL。

3 結果

方法驗證結果：

對該檢測方法進行方法學驗證結果如下：

4 分析與討論

本文對血液中納洛酮和海洛因的標志性代謝物6-單乙酰嗎啡利用液相色譜串聯質譜的檢測方法進行測試，采用正離子MRM模式下，優化了色譜條件，將單乙酰嗎啡和納洛酮進行的有效的分離，避免檢測結果出現假陽性或者假陰性。通過對目標物檢出限、定量限、線性范圍、精密度與準確度的測定，結果回收率：單乙酰嗎啡與納洛酮的回收率都在80%以上，120%以下。日內精密度與日間精密度分別小于5%和10%。表明該方法有較好的準確度和精密度。方法的線性良好，線性范圍滿足樣本中分析物的檢測要求。

作者簡介：

鐘濟聲（1986- ），男，本科，助理工程師，從事工作為法醫毒物檢測。