金烏賊端粒酶逆轉錄酶基因鑒定和組織差異表達分析*

項子龍 劉長琳 張金勇,3,4 胡 鵬,3 何暮春 柳淑芳,3 莊志猛 薛同明

金烏賊端粒酶逆轉錄酶基因鑒定和組織差異表達分析*

項子龍1,2,3劉長琳2張金勇2,3,4胡 鵬2,3何暮春5柳淑芳2,3①莊志猛2薛同明6

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；4. 南京農業大學無錫漁業學院 無錫 214081；5. 中國海洋大學生命學院 青島 266003; 6. 青島金沙灘水產開發有限公司 青島 266000)

本研究從金烏賊()轉錄組中篩選出疑似TERT (Telomerase reverse transcriptase)基因序列，通過系統進化和同源序列分析，鑒定出該基因為金烏賊TERT基因，序列長度為2415 bp。采用實時熒光定量PCR技術，檢測和分析金烏賊TERT基因在不同組織、不同發育時期和不同性別的相對表達量差異。結果顯示，與產卵期相比，瀕死期的心、肝、胰、鰓、性腺、食道上神經團(除去視腺和視葉后的腦組織)等6個組織的TERT基因表達量呈顯著下調趨勢，推測與瀕死期的器官組織分裂和增殖能力下降有關。TERT基因在金烏賊不同組織中具有明顯的組織特異性，說明金烏賊各組織器官的衰老狀態并不一致。本研究結果可為深入研究頭足類生殖與衰老等生命過程的端粒酶調控機制提供基礎數據。

金烏賊；TERT基因；qRT-PCR；系統進化樹；基因差異表達分析

端粒是真核細胞線性染色體末端的一段特殊DNA-蛋白復合體，使染色體的天然末端有別于一般性的損傷斷端，對維持細胞正常生命活動的生理內穩態起關鍵作用(Moyzis, 1988; Verdun,2007; Deng, 2007; Mergny,2002)。衰老的端粒學說(Telomere theory)認為端粒在細胞老化過程中起重要作用，每次細胞分裂都會因DNA聚合酶功能障礙而不能完全復制它們的染色體，端粒DNA序列長度逐漸縮短，最終造成細胞衰老死亡。端粒決定了細胞分裂的次數，故端粒又被稱作生命體的“分子時鐘”，端粒損耗的速度則是衡量“生物衰老”的方法之一(Spivak, 2016)。端粒酶(Telomerase)能延長端粒重復序列，維持染色體穩定，確保細胞復制能力(Wright, 1996)。因此，端粒酶具有保持端粒穩定、染色體完整、細胞活性和增殖能力等重要作用。端粒酶由端粒酶模板RNA(Telomerase RNA, TR)、端粒酶逆轉錄酶(Telomerase reverse transcriptase, TERT)和端粒酶相關蛋白構成(Wright, 1995)。TERT基因是端粒酶起作用的關鍵結構和主要調控亞單位，通過逆轉錄端粒酶RNA模板序列，合成端粒DNA重復序列并添加到染色體末端，從而彌補了端粒在細胞分裂中的消耗。研究表明，在正常細胞中導入TERT基因載體并表達，能夠促進細胞生長，延長細胞壽命，這些現象表明端粒酶在阻止細胞衰老的過程中具有重要作用(Bodnar, 1998)。

金烏賊()是頭足類鞘亞綱(Coleoidea)的代表種，一年生且終生僅繁殖1次，生殖后快速死亡，屬于一次生殖類型。這種在短時間內發生的生殖和死亡現象可以作為研究生殖、衰老和死亡之間錯綜復雜關系的切入點。依據衰老的端粒學說，金烏賊生殖后快速死亡是否與端粒DNA序列長度縮短有關？生殖前后至自然死亡過程中，TERT基因表達有什么規律？TERT基因表達量是否存在組織差異性和性別差異？為了回答這些問題，本研究從課題組前期獲得的金烏賊卵巢轉錄組數據(Zhang, 2019)中篩選出TERT基因，并選取了金烏賊的生長期(Growth Stage, GS)、產卵期(Spawning Stage, SS)、瀕死期(Aging Stage, AS) 3個關鍵生長發育階段樣品，運用qRT-PCR技術分析不同發育階段、不同組織和不同性別的TERT基因表達規律，為揭示金烏賊生殖與衰老的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金烏賊野生幼體于2016年9月捕撈自山東青島沿海，經過近1年人工培育性成熟并自然交配，于2017年7月獲得受精卵。受精卵在水溫19℃~20℃、鹽度29~30條件下孵化30 d后，獲得初孵幼體。幼體和成體培育水溫為20℃~23℃，鹽度為29~30，0~30日齡投喂活體糠蝦(Opossum shrimp)，30日齡后投喂活體小蝦和小魚，每天投喂2次，每次投餌至飽食。從2017年7月~2018年7月跟蹤采集金烏賊樣品。選取生長期、產卵期、瀕死期3個關鍵時期的金烏賊樣品，每個時期雌、雄各取3只，共采集18只金烏賊的肝臟、胰臟、性腺、鰓、食道上神經團(除去視腺和視葉后的腦組織)、心臟等組織樣品，將18組樣品液氮速凍后，隨即轉入-80℃冰箱凍存備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 TERT基因的篩選與鑒定 從課題組前期獲得的金烏賊卵巢轉錄組數據(Zhang, 2019)中篩到疑似TERT基因片段序列信息。將疑似金烏賊TERT基因序列信息與NCBI數據庫(https://www.ncbi. nlm.nih.gov)下載的已知物種TERT基因序列比對分析(表1)。用ClustalX對所有序列進行比對排序并去除兩端冗余序列，保留共有序列2415 bp。使用MEGA 6.0軟件分析序列的核苷酸組成、變異位點數等，采用鄰接法(Neighbour-joining, NJ) 構建分子系統進化樹，經1000次重復抽樣(Bootstraps)檢測其置信度(圖1)。同時，使用DNAman軟件，保留共有序列，對金烏賊以及其相物種進行同源序列分析，確定該序列與已知TERT基因的同源性。

表1 TERT基因序列信息

Tab.1 TERT gene sequence information

1.2.2 RNA提取與反轉錄 使用TaKaRaTMMini BEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。使用NanoDrop2000 (Thermo)檢測RNA濃度與純度，選擇條帶清晰純度高RNA樣品。

按照Vazyme公司HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒推薦反應體系，以前期提取合格RNA為模板，反轉錄合成cDNA。

1.2.3 引物設計 使用Primer 5.0設計TERT基因特異性擴增引物QTERT1、QTERT2和內參基因18S的特異性擴增引物Q18S，用于定量分析(表2)。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 本研究采用非特異性熒光標記SYBR Green對TERT基因在金烏賊各發育階段的組織樣品中進行相對熒光定量PCR檢測。使用ABI 7500型實時熒光定量PCR系統，TaKaRaTMTB Green Premix ExTMⅡ試劑盒，反應體系20 μl：ROXⅡ 0.4 μl；上游引物0.4 mmol/L；下游引物0.8 mmol/L；TB Green 10 μl；H2O 6 μl。使用18S作為qPCR內參基因。

反應條件為兩步法PCR擴增標準程序：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環。

1.3 數據處理

根據熒光實時定量PCR測得的值，運用2-DD法計算TERT基因的表達量。每個處理組的數據獨立分析，即同一個處理組內每個樣品的ΔΔ值為該樣品Δ值減去組內最大Δ值，通過計算得出2-ΔΔCt值便可以估算在同一處理組內各個樣品的相對表達量的差異。

分析結果均以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，并利用SPSS 16.0軟件中的單因素方差(One-way ANOVA)分析TERT mRNA表達量在不同組織及各發育時期間的差異水平。使用GraphPad Prism 5軟件繪制每個處理組相對表達量的差異圖。

2 結果與分析

2.1 TERT基因的篩選與鑒定

在NJ系統進化樹中(圖1)，金烏賊的疑似TERT基因首先與同為頭足綱的加州雙班蛸()的TERT基因聚為一支，自展支持率為100；然后，與其他軟體動物聚為一個大的類群。脊索動物門的5個種則聚成另外一個獨立分支，與無脊椎動物形成2個并列分支。DNAman軟件同源序列分析結果表明，金烏賊TERT基因序列與加州雙班蛸TERT基因序列一致性為58.28%。NJ系統進化樹分析與同源序列分析將金烏賊轉錄組數據中篩選到的疑似TERT基因鑒定為金烏賊TERT基因。

表2 TERT與內參基因18S qRT-PCR引物信息

Tab.2 qRT-PCR primer information of TERT and 18S

2.2 不同組織TERT基因表達規律

雌性金烏賊卵巢的TERT基因相對表達量最高，食道上神經團次之，接下來是心臟。隨著金烏賊生長發育過程的推進，性腺和心臟的TERT基因表達量呈逐漸下調的趨勢(<0.05)，而食道上神經團在產卵期的表達量顯著高于生長期和瀕死期(<0.05)，肝、胰、鰓等組織的表達量則一直很低(圖2)。

圖2 雌性金烏賊TERT基因在不同組織3個時期的表達

上方字母不同表示差異顯著(<0.05)。下同

Different letters indicate significant difference (<0.05). The same as below

與雌性金烏賊相似，雄性的性腺也是TERT基因相對表達量最高的組織，食道上神經團次之，接下來是心臟。但雄性金烏賊的胰臟TERT基因表達量較高，與心臟相當。在雄性金烏賊的生長發育過程中，性腺的生長期和產卵期該基因表達水平均較高(>0.05)，瀕死期卻顯著下降(<0.05)；胰臟和心臟的TERT基因表達量呈逐漸下調的趨勢(<0.05)；食道上神經團在3個階段呈先上升后下降的趨勢，且產卵期的表達量極顯著高于生長期和瀕死期(<0.01)；雖然肝臟和鰓的表達量較低，但呈現出與食道上神經團類似的趨勢(圖3)。

圖3 雄性金烏賊TERT基因在不同組織3個時期的表達

2.3 金烏賊TERT基因表達性別差異

比較雌、雄金烏賊相同組織的TERT基因表達量，生長期，僅有胰臟和食道上神經團雄性表達量高于雌性(<0.05)，肝臟、性腺、鰓、心臟在雌、雄間均無顯著性差異(>0.05)(圖4)。產卵期，卵巢TERT基因表達量極顯著高于精巢(<0.01)，其他5個組織TERT基因的表達量均較低，且不存在性別差異(>0.05) (圖5)。瀕死期，卵巢組織的TERT基因表達量急劇下降，導致卵巢中該基因表達量極顯著低于精巢組織(<0.01)，其他5個組織的表達量依舊較低，且不存在性別差異(>0.05)(圖6)。

圖4 生長期金烏賊不同組織TERT基因雌、雄表達差異比較

圖5 產卵期金烏賊不同組織TERT基因雌、雄表達差異比較

圖6 瀕死期金烏賊不同組織TERT基因雌、雄表達差異比較

3 討論

衰老又稱老化，是生物發育成熟后的一個持續發展的、動態的、緩慢的自身機能減退，結構、組分逐步退行性病變并趨向死亡的不可逆轉的現象(馬少締等, 2017)。金烏賊以其生殖后快速衰老、死亡的特點，成為研究衰老的一個理想物種。近年來，科研工作者主要從繁殖生物學、遺傳育種學、胚胎發育學等方面展開研究(王亮等, 2017; 何暮春等, 2018; 劉長琳等2018; 尹亞南等, 2018; 汪金梅等, 2017)。如果能充分了解金烏賊的衰老過程及其分子調控機制，并應用于生產，則能為漁業產量增長做出巨大貢獻，并對人類衰老研究提供一個新的視角。

TERT基因是端粒酶維持端粒長度的關鍵結構和主要調控亞單位。雖然端粒酶活性變化規律在人、小鼠、大鼠等物種的不同組織中已得到確認(Kim, 1994; Wright, 1996; Ulaner, 1997)。但是，關于海洋生物該基因的轉錄和調控規律卻所知甚少，其中一個復雜的問題是調控可能具有組織和細胞特異性(Cong, 2002; Ducrest, 2002; Mergny, 2002; Liu, 2004)。本研究發現，不同發育階段的金烏賊TERT基因在肝、胰腺、性腺、鰓、食道上神經團和心臟中均有表達，并隨著生長階段變化，性腺、心臟、胰等組織的基因表達量呈持續下降趨勢。據Kong等(2008)研究報道，TERT基因表達的差異化與目標組織細胞的增殖能力有關。組織細胞增殖能力的高低也是體現其衰老狀態的一個重要因素。因此，TERT基因表達量的下降，揭示在金烏賊生命周期中，其性腺、心臟和胰臟等器官組織的分裂和增殖能力處于下降趨勢。金烏賊性腺等組織的TERT基因表達下降與細胞增殖分裂能力的變化是否與其產卵后快速自然死亡存在有一定相關性，尚需要進一步工作來證實。

值得注意的是，雌、雄金烏賊食道上神經團的TERT基因相對表達量是在產卵期均大幅上調，瀕死期卻又大幅下調。研究發現，動物繁殖性能的高低很大程度上取決于下丘腦一垂體一性腺(HPG)軸的調節。在魚類中，魚類的性腺發育和生殖活動是由腦下垂體控制和調節的，而腦下垂體又在下丘腦控制之下(王良臣, 1987)。而頭足類中樞神經系統的食道上神經團支配視腺調節性腺發育與成熟，視腺類似于脊椎動物的腦垂體，而食道上神經團類似于脊椎動物的下丘腦(Wells, 1959、1972)。推測產卵盛期的金烏賊受中樞神經系統的食道上神經團調控，激活TERT基因，從而增強性腺細胞的增殖能力，促進金烏賊性腺成熟和產卵，以適應金烏賊產卵期的生理需求。

通過實驗發現，TERT基因在金烏賊不同組織中具有明顯的組織特異性，食道上神經團與性腺中高表達，在其他組織中低表達，尤其在肝、鰓和心臟組織中表達量最低，說明金烏賊各組織衰老狀態并不一致。這一結果與青鳉()的相關研究結果相似。在青鳉中胚胎期和成體分化組織中均有TERT基因表達，在成體組織中性腺和腦發現了TERT基因高表達(Frank, 2008)。同時，黑點青鳉() (Yu, 2006)和河豚() (Yap, 2005)中的TERT基因組織間差異表達與本研究結果相似，均表現為性腺TERT基因高表達，而肝臟、鰓、心臟等組織均低表達。本研究結果顯示的性腺與其他組織的表達差異更大。

本研究結果還顯示，金烏賊TERT基因表達具有雌、雄性別間差異。產卵期，雌性金烏賊性腺組織TERT基因相對表達量顯著高于雄性(<0.05)；瀕死期，雄性金烏賊性腺組織TERT基因相對表達量顯著高于雌性(<0.05)，其他組織低表達，無顯著差異(>0.05)。這種性別差異與大西洋鱈()和歐洲鱈() (López de, 2014)的研究結果并不一致，大西洋鱈與歐洲鱈TERT基因在性腺表達不具有顯著差異，這種差異可能是物種差異性造成的。

4 小結

本研究從金烏賊轉錄組數據中成功篩選出端粒酶TERT基因，鑒定出的序列長度為2415 bp，NJ系統進化樹分析顯示，金烏賊與加州雙班蛸的TERT基因遺傳距離較近，二者同源性為58.28%。金烏賊生活史關鍵階段的TERT基因相對表達差異分析表明，與產卵期相比，瀕死期的心、肝、胰、鰓、性腺、食道上神經團(除去視腺和視葉后的腦組織)等6個組織TERT基因表達量呈顯著下調趨勢，推測與瀕死期的器官組織分裂和增殖能力下降有關。TERT基因在金烏賊不同組織中具有明顯的組織特異性，說明金烏賊各組織器官的衰老狀態并不一致。

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Gene Identification and Tissue Differential Expression Analysis ofTelomerase Reverse Transcriptase

XIANG Zilong1,2,3, LIU Changlin2, ZHANG Jinyong2,3,4, HU Peng2,3, HE Muchun5, LIU Shufang2,3①, ZHUANG Zhimeng2, XUE Tongming6

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 4. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081; 5. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003; 6. Qingdao Jinshatan Aquatic Product Development Co., Ltd., Qingdao 266000)

Telomerase reverse transcriptase (TERT) gene is a key structure and major regulatory subunit of telomerase. TERT synthesizes telomeric DNA repeats by reverse transcription of telomerase RNA template sequences and adds them to the ends of chromosomes to maintain and extend the ends. Golden cuttlefish () is an annual species that dies quickly after spawning. This characteristic makes it a potential research object for the study of reproduction and aging. In this study, the phylogenetic and homologous sequence analysis revealed that the gene was aTERT gene with a sequence length of 2415 bp. Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) was used to detect the relative expression of TERT gene in the growthstages, spawningstages and aging stages of, and to analyze life cycle differences and gender differences. The research results show that TERT gene expression in six tissues, including heart, liver, pancreas, gill, gonad and esophageal nerve mass, showed a downward trend, which was supposed to be related to the decline of organ division and proliferation in the near-death stage. TERT gene has obvious specificity in different tissues of,. It shows that the aging status of different tissues and organs ofis different. The results of this study can provide basic data for the further study of the regulation mechanism of Telomerase in reproduction and senescence of cephalopod.

; TERT gene; qRT-PCR;Phylogenetic tree;Gene differential expression analysis

LIU Shufang, E-mail: liusf@ysfri.ac.cn

* 國家自然科學基金項目(31672645)、中國水產科學研究院基本科研業務費專項(20603022016001)和山東省泰山學者建設工程專項共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31672645), Scientific Institution Basal Research Fund, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022016001), and Taishan Scholar Project, Shandong Province]. 項子龍，E-mail: xiangzilong0818@163.com

柳淑芳，研究員，E-mail: liusf@ysfri.ac.cn

2019-03-26,

2019-04-21

S931.1

A

2095-9869(2020)03-0158-07

10.19663/j.issn2095-9869.20190326001

http://www.yykxjz.cn/

項子龍, 劉長琳, 張金勇, 胡鵬, 何暮春, 柳淑芳, 莊志猛, 薛同明. 金烏賊端粒酶逆轉錄酶基因鑒定和組織差異表達分析.漁業科學進展, 2020, 41(3): 158–164

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(編輯 馮小花)