125I 放射性粒子對人肺鱗癌H520 細胞荷瘤裸鼠VEGF表達的影響

劉登堯，李建邦，黃伍奎，楊樹法，樊喜文

（新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 介入診療科，新疆 烏魯木齊）

0 引言

組織間內照射治療作為非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）的一種輔助治療手段，對于經傳統放化療后效果不佳的患者，是一種較好的局部治療選擇[1]。125I粒子組織間近距離治療可通過持續釋放低劑量率射線造成物理損傷有效控制局部腫瘤，同時刺激分泌各種細胞因子啟動細胞凋亡，抑制血管內皮細胞生長[2]。本研究探討125I 粒子抑制人肺鱗癌裸鼠移植瘤生長的作用機制，旨在為臨床提供一定的實驗依據。

1 資料與方法

1.1 資料

肺癌細胞株H520（上海名勁生物科技有限公司），健康雄性BALB/c 裸鼠20 只，體重20.0～25.0 g。125I 粒子，6711-99 型，粒子長4.5 mm，直徑0.8 mm，活度分別為22.2 MBq、0 MBq（空源粒子），半衰期59.43 d。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

復蘇H520 細胞，混勻制成細胞懸液，置于37 °C、5%CO2培養。

1.2.2 裸鼠移植瘤建模

實驗前24 h 禁食，自由飲水。取對數生長期的H520 細胞制成濃度為1×107細胞/100 μL 的單細胞懸液，取100 μL接種于裸鼠右上肢皮下，每兩天用游標卡尺測量移植瘤長短徑。當體積達1000 mm3時建模成功，進行粒子植入。

1.2.3 動物分組及粒子植入

按隨機數字表法將模型裸鼠平均分為實驗組和對照組。造模成功后，瘤體體積達1 cm3進行粒子植入，實驗操作者做好射線防護，用徒手穿刺植入法，將放射性粒子植入移植瘤內。根據實驗設計不同，實驗組和對照組分別植入活度為22.2 MBq 和0 MBq 的粒子各1 顆。各組動物分籠飼養。

1.3 移植瘤生長情況

分別于粒子植入前、粒子植入后直至第30 天，期間每隔2 d 測量腫瘤的長徑（A）和短徑（B），按公式計算腫瘤相對體積（V）=A×B2/2，觀察兩組的體積曲線變化趨勢[3]，在皮下移植瘤體積達1000 mm3時用乙醚麻醉裸鼠后處死，移植瘤置于-80 ℃中保存。

1.4 VEGF 蛋白表達

常規制備移植瘤組織切片，脫蠟，水洗。抗原修復：高壓修復：鍋內倒入0.01 M 檸檬酸鈉緩沖液，溫度調到最大，高壓鍋置氣后開始計時2 min45 s，脫蠟至水：脫蠟液Ⅰ 20 min，脫蠟液Ⅱ 20 min，脫蠟液Ⅲ 20 min，脫水后放入80%乙醇浸泡8 min，水洗。抗原修復：高壓修復：鍋內倒入0.01 M 檸檬酸鈉緩沖液，溫度調到最大，高壓鍋置氣后開始計時2 m i n 4 5 s，自然冷卻。滅活：將處理后的組織玻片擦干，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，置于室溫（25 ℃）避光處理10 min 后，PBS 洗。一抗孵育：將處理后的組織玻片擦干，每張片子加150 μL 抗體（抗體用專用稀釋液稀釋，含血清），37 ℃孵育1 h，后PBS 洗。滴加增強酶標羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，室溫靜置20 min，PBS 洗。DAB 顯色3 min，水洗。復染后脫水：80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，無水乙醇5 min，透明液Ⅰ5 min，透明液Ⅱ5 min。中性樹膠封片。鏡下觀察，當視野中細胞內出現棕黃色深染顆粒為陽性。半定量結果分析：在20 倍鏡視野測量相對灰度值，相對灰度值=（背景灰度值-實測灰度值）[4]，值越小，代表該蛋白表達越高。

1.5 VEGF mRNA 表達

采用熒光定量PCR 法檢測移植瘤組織VEGF mRNA表達。mRNA 相對表達量運用ABI7500 軟件（美國應用生物系統公司）進行分析，采用法。RNA 反轉錄后擴增（Roche Lightcycler 480 Ⅱ）。引物、內參序列以及反應條件，如表1 所示。

表1 引物序列

1.6 數據處理統計分析

2 結果

2.1 腫瘤生長情況

經大體觀察測量，實驗組與對照組瘤體生長趨勢均穩定增長，實驗組從125I 粒子植入后第10 天開始，腫瘤體積增長速度開始放緩，在第20 天后直至第30 天實驗組的生長曲線更為平坦，與對照組曲線的差距比逐漸增大。

2.2 VEGF 蛋白表達

免疫組化檢測實驗組與對照組人肺鱗癌H520 細胞移植瘤組織中VEGF 蛋白的表達水平。結果顯示，在30 d 后對照組和實驗組瘤組織免疫組化切片中VEGF 均有陽性表達（胞質和細胞表面呈深棕色）。但兩組表達情況有不同，經進一步分析發現對照組VEGF 陽性表達水平明顯高于實驗組，相對灰度值為（130.7±9.2）（92.7±7.2）。

2.3 VEGF mRNA 表達

熒光定量PCR 實驗結果，在粒子植入后30 d，實驗組、對照組VEGF mRNA 表達情況不同，經數據轉換后分別為（0.279±0.065）（0.923±0.088）（P＜0.05）。

3 討論

放射性粒子植入在國外批準應用于前列腺癌的治療。作為一種局部近距離內照射放療經我國學者引進后，經過多年努力和改進，配合各種輔助引導方式，目前該治療技術正廣泛地應用于體部各部位實體惡性腫瘤的臨床治療，越來越多的患者從中獲益[5]。125I 粒子的有效輻射距離約為1.7 cm，因此它具有靶區內高劑量、靶區外低劑量的特點，可以避免對周圍正常組織和器官的影響。我們團隊前期的臨床研究發現，放射性粒子聯合靜脈標準化療方案用于不可手術的晚期非小細胞肺癌患者，相較于單獨使用化療的患者，聯合治療組局部控制率高（78.4% vs 56.4%），1 年生存率高（66.7% vs 45.3%），兩組不良反應發生率無明顯差異，提示粒子治療具有良好的近期療效和安全性，但患者能否從粒子治療中獲得長期生存仍需進一步研究[6]。由于粒子治療的生物學特性，許多學者對其抑瘤生長機制開展大量研究。眾所周知，血管內皮生長因子（VEGF）通過與特征性受體（VEGFR）相結合，激活下游信號通路，介導級聯反應促進血管新生過程[7]。本次研究結果顯示，具有放射活度的粒子植入荷人肺鱗癌H520細胞裸鼠移植瘤后，實驗組VEGF 表達水平降低（P＜0.05），表明放射性125I 粒子可在蛋白和基因水平降低人肺鱗癌組織VEGF 表達。同姚傳山等的研究結果類似[8]。此外，本研究觀察到實驗組植入22.0 MBq 活度粒子后，在30 d 的實驗觀察期內移植瘤體積生長速度逐漸減慢，但經過分析，兩者差異并無統計學意義（P＞0.05），推測可能實驗設定觀察期較短，未達到粒子的自然半衰期所致，部分研究發現延長實驗時間超過半衰期時，可觀察到體積差異存在統計學意義[9-13]。

綜上所述，放射性125I 粒子可抑制人肺鱗癌H520 細胞荷瘤裸鼠移植瘤的生長，在蛋白水平和基因水平均能抑制VEGF 的表達，推測粒子治療可能通過影響該因子的表達發揮抑制腫瘤生長[14-15]。