超極化激活環核苷酸門控陽離子通道亞型在大鼠脊髓背角淺層的特異性表達*

2020-06-09 02:41:50黃姣艷程小娥馬龍先張達穎蔣昌宇濤3

中國病理生理雜志 2020年5期

黃姣艷，程小娥，馬龍先，張達穎，蔣昌宇，柳濤3，△

（南昌大學第一附屬醫院 1麻醉科，2疼痛科，3醫學科研中心，江西南昌330006；4深圳市南山醫院韓濟生院士疼痛醫學工作站，廣東深圳518052）

超級化激活環核苷酸門控陽離子通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels，HCN channels）有HCN1～4共4種亞型，主要表達在神經細胞和心肌細胞的胞膜上，與癲癇、抑郁、疼痛以及心臟疾病的發生發展有著密切的關聯［1-4］。脊髓背角（spinal dorsal horn，SDH）是外周傷害性信息向中樞傳遞的初級門戶，該區域的HCN通道已被證實在慢性疼痛的發生發展中具有重要的作用。例如大鼠脊髓背角HCN2的表達在慢性炎性痛后顯著增加，而阻斷或抑制HCN通道可大幅減輕神經病理性疼痛和炎性痛模型動物的痛行為［5-7］。SDH由淺至深分為Ⅰ～Ⅵ層，其中Ⅰ～Ⅱ層構成脊髓背角淺層，對疼痛的傳遞與整合起著重要的調控作用。我們近期研究初步表明，HCN通道在脊髓背角淺層廣泛表達，且HCN4與興奮性軸突末梢標志物囊泡谷氨酸轉運體2（vesicular glutamate transporter 2，VGLUT2）顯著共染［8-9］，但HCN通道在神經元和膠質細胞中的具體表達情況及在神經元亞細胞結構如樹突、軸突等部位的分布尚不清楚。因此，本研究應用免疫組織化學和激光共聚焦成像技術，觀察SDH中HCN通道的4種亞型在正常大鼠脊髓背角淺層的特異性分布情況，以期為進一步揭示SDH的HCN通道在痛信號通路中的作用提供參考資料。

材料和方法

1 動物

3～5周齡清潔級 Sprague-Dawley（SD）大鼠 27只，體重80～100 g，雌雄不拘，來源于南昌大學動物中心［許可證號為SYXK（贛）2005-0001］。動物實驗嚴格遵循《南昌大學實驗動物管理辦法》和《南昌大學動物實驗倫理審查》的原則進行。實驗大鼠飼養于清潔籠具中，室內光照保持12 h/12 h晝夜循環，室溫控制在20～25℃，相對濕度在65%～70%之間，自由飲食。

2 主要試劑及儀器

抗HCN1～4抗體購自Alomone Labs；抗膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、抗降鈣素基因相關肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）抗體和抗軸突神經絲SMI-312抗體購于Abcam；抗神經元核抗原（neuronal nuclei，NeuN）抗體和抗囊泡γ-氨基丁酸轉運體（vesicularγaminobutyric acid transporter，VGAT）抗體購于 Synaptic Systems；抗小膠質細胞抗體（CD11b/c，OX-42）和抗VGLUT2抗體購自Millipore；抗異凝集素B4（isolectin B4，IB4）抗體購于Vector Labs；Alexa Fluor（AF）488、AF546、AF555和AF647標記的熒光Ⅱ抗均購于Molecular Probes；Cy5和rhodamine標記的熒光Ⅱ抗購于Jackson ImmunoResearch Labs；冰凍切片機（CM1950）購自Lecia。激光共聚焦顯微鏡（LSM700）及圖像分析軟件（ZEN 2010）購自 Carl Zeiss。

3 主要方法

3.1 免疫組織化學染色脊髓切片制備給大鼠腹腔注射烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉后開胸暴露心臟，用預冷的0.9%NaCl 100 mL行心臟灌流，再以4%多聚甲醛（pH 7.4，4℃）150 mL灌注固定，灌畢立即剪開大鼠背部皮膚，分離脊柱兩側肌肉、離斷兩側肋骨，取出連同脊髓的脊柱，并完全浸入4%多聚甲醛中。以腹側入路切除椎板，以腰骶膨大部為中心游離出脊髓（腰1～骶3），于顯微鏡下剝離脊髓表面硬脊膜、軟脊膜及附著神經根。取出脊髓放入4%多聚甲醛中固定6 h，充分漂洗后置于30%蔗糖溶液3 d（4℃），取出脊髓，切去脊髓頭尾，留取L4～L5腰骶膨大部，OCT包埋劑包埋，用冰凍切片機連續橫向切片（片厚30 μm），放置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液中存放，按下述方法進行免疫熒光染色。

3.2 免疫熒光組織化學染色方法將上述脊髓橫切片在0.01 mol/L PBS液中充分漂洗后進行常規漂染：Ⅰ抗 HCN1～4（1∶200）分別與神經元標志物NeuN（1∶200）、星形膠質細胞標志物 GFAP（1∶2 000）、小膠質細胞標志物OX-42（1∶200）、非肽能初級傳入軸突末梢標志物IB4（1∶100）、肽能初級傳入軸突末梢標志物CGRP（1∶100）、神經元樹突標志物微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2；1∶1 000）、神經元軸突標志物 SMI-312（1∶1 000）和抑制性中間神經元軸突末梢標志物VGAT（1∶1 000）進行共染，于4℃搖床上孵育3 d。挑出脊髓片用PBS漂洗3次，每次5 min，加入與Ⅰ抗種屬對應的Ⅱ抗 AF488（1∶500）、AF546（1∶400）、AF555（1∶400）、AF647（1∶400）、rhodamine（1∶1 000）和Cy5（1∶400）于4℃搖床上孵育過夜，取出脊髓片充分漂洗后封片。用激光共聚焦顯微鏡采集10倍（×10）、40倍（×40）及63倍（×63，油鏡）的圖像進行分析處理，根據實際情況調節 Z值（0.5～1 μm）。HCN1～4抗體的特異性已在我們之前的研究中得到驗證［9］。

3.3 熒光定量分析采用ZEN 2010分析軟件自帶的熒光定量功能，測定HCN1～4在SDHⅠ～Ⅱ層內側帶、中側帶和外側帶的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），圖像均取自同一放大倍數（×10，zoom=1），從每只大鼠切取的脊髓片中隨機挑取2～3張，在兩側背角Ⅰ～Ⅱ層內、中、外側帶各取150 pixel×150 pixel正方形方框并測量方框內的MFI，再取同樣大小的方框置于空白處以測定背景MFI，用來標準化HCN1～4的MFI（兩者相減），取均值作為其MFI。采用上述同種方法，圖像取同一放大倍數（×10，zoom=0.5），定量分析HCN1～4在脊髓灰質各層（Ⅰ～Ⅱ層、Ⅲ～Ⅳ層和Ⅴ～Ⅵ層）及白質內的MFI。

3.4 共定位分析采用ZEN 2010分析軟件自帶的共染定量分析功能，測定并分析HCN1～4分別與SDH Ⅰ～Ⅱ層各標志物NeuN、GFAP、OX-42、MAP2、SMI-312、CGRP、IB4和VGAT的共定位情況。圖像均取自同一放大倍數（×40，zoom=1），從每只大鼠切取的脊髓片中隨機挑取2～3張，統計每張脊髓片兩側背角內、中、外側帶400 pixel×400 pixel正方形方框內HCN1～4分別與各標志物的共定位系數，并取其均值作為最終共定位系數。

4 統計學處理

所有計量資料以均數±標準誤（mean±SEM）表示。采用SPSS17.0統計軟件進行統計學分析，數據經正態性和方差齊性檢驗后，兩組獨立樣本間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組及以上樣本間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 HCN通道在脊髓的大體分布

采用免疫組化染色方法，觀察HCN1～4在脊髓中的分布模式，結果顯示HCN通道的4種亞型均在脊髓灰質中表現出較強的熒光信號，而在白質中熒光信號微弱，見圖1A～D。進一步熒光定量分析結果顯示HCN1～4在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層內側帶、中側帶和外側帶的MFI無顯著差異（P＞0.05），見圖1E。

Figure 1.Distribution of HCN1～4 in the spinal cord.A～D：representative images of immunolabeling of HCN1，HCN2，HCN3 and HCN4 in the spinal cord（scale bar=200μm）；A1～D3：the enlargements of the areas showing in the box in A～D（from top to bottom），respectively（scale bar=20 μm）；E：the mean fluorescence intensity（MFI）of HCN1～4 in the lateral，central and medial dorsal horn.Mean±SEM.n=11.圖1 HCN通道亞型在脊髓的大體分布

此外，HCN2～4主要集中分布在脊髓背角Ⅰ～Ⅱ層，其MFI與其它各層及白質之間均有顯著性差異（P＜0.01）；而HCN1灰質MFI雖與白質的MFI相比有顯著差異（P＜0.01），但其Ⅰ～Ⅱ層MFI與其它各層的MFI相比，無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 HCN1～4在脊髓背角Ⅰ～Ⅵ層和白質中分布的平均熒光強度Table 1.The MFIof HCN1～4 in laminaeⅠ～Ⅵ and white matter of the spinal cord（Mean±SEM）

2 HCN通道在脊髓背角神經元及膠質細胞上的分布

為明確HCN1～4蛋白表達的細胞類型，我們觀察了HCN1～4與NeuN和GFAP、OX-42的共染情況，見圖2及表2、3。有11.2%的GFAP、8.7%的OX-42和4.8%的NeuN與HCN1共染；31.7%的NeuN和5.8%的GFAP與HCN2共染，OX-42與HCN2共染少（3%）；38.6%的NeuN與HCN3共染，而GFAP和OX-42與HCN3幾乎無共染（均＜1%）；7.2%的GFAP與HCN4共染，NeuN和OX-42與HCN4共染少（分別為1.5%和5%）。此外，NeuN與HCN1～4的共染占HCN1～4的百分比分別為12.6%、45.6%、64.7%和2.2%，GFAP與HCN1～4的共染占HCN1～4的百分比分別為5.2%、2.3%、0.4%和3%，OX-42與HCN1-4的共染占HCN1～4的百分比分別為3.5%、1.3%、0.4%和1.6%。

3 HCN通道在脊髓背角初級傳入神經末梢的分布

通過檢測HCN通道在脊髓背角初級傳入神經末梢的分布觀察到IB4與HCN4存在共染，而與HCN1～3幾乎不共染，見圖3A。CGRP與HCN2和HCN4存在共染，與HCN1和HCN3不共染，見圖3B。

定量分析結果表明，IB4和CGRP與HCN通道各亞型共定位存在顯著差異（P＜0.05），其中6.7%的IB4與HCN4共染，9.2%的CGRP與HCN2共染，IB4、CGRP與HCN1共染少（分別為1.1%和2.1%），而IB4和CGRP與HCN3均無共染（分別為0.3%和0.9%），見表2。此外，9.5%的HCN4與IB4共染，6.3%的HCN2與CGRP共染，見表3。

4 HCN通道在脊髓背角中間神經元樹突和軸突的分布

HCN1、HCN4與MAP2存在共染，HCN2、HCN3與MAP2幾乎無共染；SMI-312與HCN1～4共染均不顯著，見圖4。

定量分析結果顯示，6%和8.7%的MAP2分別與HCN1和HCN4共染，MAP2與HCN2和HCN3的共染系數分別為2.8%和0.5%；SMI-312與HCN1～4的共染系數分別為3.8%、1.2%、0.5和4.4%，見表2。此外，8.9%的HCN4與MAP2共染，而2%的HCN1與SMI-312共染，見表3。

5 HCN通道在脊髓背角中間神經元軸突末梢的分布

為明確HCN1～4在抑制性軸突末梢的分布情況，我們將其與抑制性中間神經元軸突末梢標志物VGAT共染，見圖5。

定量分析結果顯示，15.9%的VGAT與HCN4共染，而VGAT與HCN1～3幾乎不共染（分別為2.3%、1.6%和0.5%）；同時14.7%的HCN4共表達VGAT，見表2、3。

討論

1 HCN通道在脊髓的大體分布

背角淺層是傷害性信息由外周傳入高級中樞的第一個中繼站，Ⅰ層由投射神經元和中間神經元組成，Ⅱ層的SG區則是“閘門控制理論”的核心組成部分，閘門的開放與關閉決定了疼痛信息能否繼續向上傳遞，在慢性疼痛的發生與發展過程中具有至關重要的作用［10-12］。因此，HCN通道在脊髓背角淺層的表達尤為被學者們關注。在成年雄性Wistar大鼠或C57BL/6小鼠中，HCN2主要位于脊髓背角的Ⅰ和Ⅱ外層（Ⅱo）［13-14］，HCN4 則主要位于Ⅰ和Ⅱ內層（Ⅱi）［15］。與上述結果一致，我們近年已發表的工作表明HCN亞型在脊髓背角Ⅰ～Ⅵ各層均有分布，且以Ⅰ～Ⅱ層為主［9］。由于SG神經元隨著放電模式的不同，在脊髓背角呈現不同的分布模式，如適應性放電神經元主要分布在SG區的外側帶［16］。因此，有必要明確HCN1～4在脊髓背角淺層的內、中、外側帶是否存在差異性表達。本研究結果顯示它們之間的分布無顯著差異，進一步的定量分析顯示，HCN2～4在脊髓背角的分布主要以Ⅰ～Ⅱ層為主。由于Ⅰ～Ⅱ層與痛信號的傳遞密切相關，因此HCN通道在該區域的高表達表明其在疼痛的調制中可能具有重要的作用。

Figure 2.Specific localization of HCN isoforms in different cell types in spinal dorsal horn.A：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and NeuN（red）in superficial spinal dorsal horn；B：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green），GFAP（blue）and OX-42（red）in superficial spinal dorsal horn.圖2 HCN亞型在脊髓背角細胞中的特異性表達

2 HCN通道在脊髓背角細胞水平上的分布

Figure 3.Distribution of HCN isoforms in the primary afferent nerve endings of the spinal dorsal horn.Representative images of coimmunostaining for HCN1～4（green），IB4（blue）and CGRP（red）in superficial spinal dorsal horn were shown.圖3 HCN通道各亞型在脊髓背角初級傳入神經末梢的分布

脊髓背角主要由神經元和膠質細胞組成，后者主要包括星形膠質細胞和小膠質細胞。活化的膠質細胞通過釋放多種炎性細胞因子如腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β等致神經病理性疼痛膠質細胞的激活是神經痛發病的重要因素，葛根素［17］及小膠質細胞抑制劑米諾環素［18］等可減少這些致痛物質的生成以有效緩解疼痛。我們已發表的研究觀察到米諾環素可在數分鐘內顯著降低SG神經元的HCN通道介導的電流（Ih）的振幅從而降低其興奮性［19］，證實了米諾環素鎮痛的神經機制。那么米諾環素有無可能通過作用于膠質細胞的HCN通道而發揮作用呢？在大鼠的大腦皮質和海馬中，Honsa等［20］檢測到這兩個區域的星形膠質細胞在生理情況下表達極少量的HCN1～3，在缺血刺激下，這些細胞的HCN1～3可顯著增加，而HCN4在生理和病理情況下均未發現有表達。但是，HCN通道在脊髓背角的膠質細胞是否存在表達尚不明確。本研究首次揭示正常情況下脊髓背角的星形膠質細胞表達HCN1、HCN2和HCN4通道，而HCN3與星形膠質細胞無共定位。由于病理性疼痛狀態下星形膠質細胞顯著激活，HCN通道的表達有可能如上述缺血刺激亦大幅上升，從而加重疼痛。另一方面，雖然脊髓背角HCN1與小膠質細胞標志物OX-42存在少量共染，但其余3種亞型與OX-42均幾乎無共定位，表明小膠質細胞的HCN通道對疼痛的作用有限。此外，多個電生理研究均已在背角淺層神經元上記錄到Ⅰh［19，21］，本研究觀察到NeuN共染較多的亞型為HCN2和HCN3。研究表明，脊髓背角淺層的神經元多為中間神經元［22］，84.1%小清蛋白陽性神經元和53.9%的PKCγ陽性神經元被檢測有HCN4表達［15］，此外，HCN4還被檢測到表達在不含鈣結合蛋白的Pax2陽性的背角Ⅱ層神經元中［23］。目前HCN通道在SDH中間神經元的定位尚不完全清楚，進一步研究HCN通道在脊髓背角中間神經元亞群中的分布，對闡明HCN通道在神經病理性疼痛和炎性痛中的作用具有至關重要的作用。

Figure 4.Distribution of HCN isoforms in dendrites and axons of interneurons in spinal dorsal horn.A：representative images of coimmunostaining for HCN1～4（green）and MAP2（red）in superficial spinal dorsal horn；B：representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and SMI-312（red）in superficial spinal dorsal horn.圖4 HCN通道亞型在脊髓背角神經元樹突和軸突中的分布

Figure 5.Distribution of HCN isoforms at axonal terminal of inhibitory interneurons in spinal dorsal horn.Representative images of co-immunostaining for HCN1～4（green）and VGAT（red）in superficial spinal dorsal horn were shown.圖5 HCN通道亞型在脊髓背角抑制性中間神經元軸突末梢的分布

3 HCN通道在脊髓背角神經元亞細胞水平上的分布

脊髓背角接收來自初級傳入軸突的輸入信號，其遞質主要有肽能（P物質和CGRP）和非肽能（IB4）兩種。IB4陽性的傳入神經纖維不參與正常的機械傷害感受，但能被炎癥刺激致敏并在介導機械性炎癥超敏反應中起關鍵作用［24］。而CGRP標記陽性的肽能初級傳入神經元也與炎癥性疼痛相關［3］。以往研究表明，HCN2主要與CGRP和SP共染，而與IB4幾乎無共染［13-14，25］。與該結果類似，我們亦觀察到HCN2主要與CGRP共染，與IB4無共染，同時我們首次發現HCN4與IB4存在共定位，揭示了HCN通道各亞型在傷害性初級傳入神經末梢中有其獨特的表達模式，其中HCN2和HCN4是分布在傷害性初級傳入末梢的主要類型。本課題組在近年的一項研究中已證實HCN1～4亞型在興奮性突觸末端有表達，且以HCN4為主［8］。本研究進一步發現HCN1～4與VGAT均有共定位，HCN4的共定位明顯高于其他亞型。以上結果提示，在結構功能和表達上，HCN4與中間神經元軸突末梢存在緊密且復雜的聯系。樹突和軸突是神經元接收和傳出信息的兩個主要結構，Jiang等［26］檢測到慢性壓迫模型誘導的神經病理性痛模型大鼠中，受損坐骨神經的HCN1和HCN2顯著增加，表明周圍神經的軸突上存在HCN表達。本研究首次發現背角淺層的HCN1和HCN4與樹突標志物少量共染，與軸突標志物幾乎不共染，可能與背角Ⅱ層的解剖構成有關，即脊髓薄片的Ⅱ層在光學顯微鏡下表現為半透明狀，主要原因是此層的軸突較少。在SMI-312表達稍多的Ⅲ層，HCN1和HCN4均與其存在不同程度的共染。以上結果表明HCN1和HCN4在背角淺層神經元接收信息的過程中發揮一定的作用。