妊娠期脂多糖暴露通過激活子代小膠質細胞誘導大鼠孤獨癥樣行為*

俸 笛，陳保林，肖 露，楊 亭，陳 潔，孫五慶

（重慶醫科大學附屬兒童醫院兒童營養研究中心，國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心，兒童營養與健康重慶市重點實驗室，兒童發育疾病研究教育部重點實驗室，兒童發育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶400014）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是1943年由Kanner提出的一組以社會交往障礙以及重復刻板行為為特征的神經發育障礙性疾病［1］。盡管ASD的患病率在世界范圍內呈逐年上升趨勢［2］，但其具體發病機制尚不清楚，防治方法非常受限，給ASD患兒的家庭帶來了嚴重的負擔。臨床研究表明妊娠期間的母源性免疫激活（maternal immune activation，MIA）會對發育中的胎兒產生影響，增加其子代患自閉癥的風險［3］。

小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞，是中樞神經系統損傷的主要防御細胞［4］。一般認為小膠質細胞有兩種不同的表型，即具有促炎功能的M1型和具有免疫抑制功能的M2型［5］。有研究發現，炎癥細胞因子的增加及小膠質細胞的持續激活可能導致機體呈慢性炎癥狀態，引起神經損傷及發育障礙［6］。同時有學者發現孤獨癥患者大腦中存在免疫功能異常［7］。Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種跨膜受體，在腦組織中主要表達于神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞上，參與小膠質細胞介導的炎癥反應，并導致白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等的產生和分泌［8］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是TLR4的特異性配體，通過脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）介導與CD14的結合，激活TLR4信號通路［9］。大鼠孕期腹腔注射LPS可模擬人類妊娠期感染，是一種較常見的MIA動物模型［10］，通過對其子代的行為學檢測，可觀察子代是否存在社會交往障礙、重復刻板等孤獨癥樣行為。因此，本研究利用LPS誘導妊娠期MIA大鼠模型，檢測仔鼠孤獨癥樣行為，分析小膠質細胞不同亞型及TLR4表達水平的變化，探討小膠質細胞表型與孤獨癥樣行為的相關性。同時體外培養N9小膠質細胞系，利用TLR4抑制劑TAK242，探討小膠質細胞分型與TLR4的聯系。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級健康雌性8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體質量190～210 g，購買自重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（渝）2018-0003，飼養于重慶醫科大學附屬兒童醫院IVC（individually ventilated caging）級實驗動物中心，使用許可證號為SYXK（渝）2017-0012。所有動物實驗流程通過重慶醫科大學動物中心實驗動物倫理委員會核準。

2 實驗主要試劑

LPS（Sigma）；TLR4、離子鈣結合銜接分子 1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，IBA-1）、iNOS、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）和GAPDH引物序列（北京華大公司）；總mRNA提取試劑盒和RIPA裂解液（BioTeke）；逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑盒（TaKaRa）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Bio-Rad）；抗IBA-1和iNOS抗體（Abcam）；抗Arg-1抗體（Genetex）；抗TLR4抗體（Santa Cruz）；IL-10及TNF-α酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（RayBiotech）；LBP ELISA 試劑盒（Arigobio）。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組及模型構建 參照Fernández等［11］及本實驗室已發表文獻［12-13］的方法構建孤獨癥樣行為的大鼠模型。雌雄大鼠1∶1放入籠子過夜，第2天早晨觀察到陰栓的雌鼠記為懷孕第1天（gestation day 1，G1），并將其單獨飼養。如圖1所示，將24只孕鼠隨機平分成LPS組和磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）組（n=12），在G9.5時LPS組孕鼠腹腔注射100μg/kg LPS，PBS組腹腔注射等體積PBS。腹腔注射24 h后，每組孕鼠隨機抽取3只收集孕鼠血清檢測LBP及TNF-α，驗證模型構建是否成功。每組剩余9只孕鼠待其自然生產（每只孕鼠產仔8～10只），本研究中每只母鼠哺乳8只仔鼠，即每組仔鼠共72只（n=72）。為排除不同行為學測試可能對大鼠腦組織產生影響，每組隨機抽取42只子代大鼠在生后第42～56天分別進行三箱社交實驗（n=14）、嗅覺適應/去適應實驗（n=14）及曠場實驗（n=14），每組剩余的30只仔鼠用于real-time PCR、Western blot、免疫熒光等實驗。

Figure 1.Diagramillustrating the experimental protocols in the rats in vivo.圖1 動物體內實驗流程圖

3.2 生物標本的采集及處理 孕鼠G9.5腹腔注射LPS或PBS24 h后，麻醉后股動脈取全血約2 mL，血標本靜置0.5 h后以1 000×g離心15 min，留取上清，凍存于-80℃冰箱。各組子代大鼠8周齡時麻醉后冰上取腦前額葉皮質，凍存于-80℃備用。

3.3 N9細胞培養及處理 從液氮中取出N9細胞系，迅速復蘇后種于10 cm的培養皿中，加入含10%FBS的DMEM/F12培養液（內含1%青霉素及鏈霉素），在37℃、5%CO2培養箱中培養，每天更換新鮮培養液。待細胞傳至P3代后種于6孔板中，分為3組：（1）對照（control）組；（2）LPS組；（3）TAK242+LPS組。其中第3組予以50μmol/L TAK242干預4 h后加入3 mg/L LPS處理12 h，第2組則加入同等體積DMSO（TAK242的溶劑）處理4 h后予以3 mg/L LPS處理12 h。

3.4 real-time PCR檢測 提取前額葉皮質或N9細胞總mRNA，將mRNA逆轉錄為cDNA，在Bio-Rad實時熒光定量PCR儀上進行qPCR擴增。各目的基因以GAPDH為內參照。IBA-1的上游引物序列為5′-TGGATGGGATCAACAAGCAC-3′，下游引物序列為5′-GGAGCCACTGGACACCTCTC-3′；Arg-1 的上游引物序列為5′-GGGAAGGTAATCATAAGCCAGA-3′，下游引物序列為5′-CCCAGATGACTTTTATGCGATG-3′；iNOS 的 上 游 引 物 序 列 為 5′-CGCTACACTTCCAACGCAACA-3′，下游引物序列為 5′-GAACAATCCACAACTCGCTCCA-3′；TLR4的上游引物序列為5′-TAGCCGCTCTGGCATCAT-3′，下游引物序列為 5′-GCATTGTCCTCCCACTCG-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAG-3′，下游引物序列為5′-CACAGGAGACAACCTGGTCC-3′。

3.5 Western blot檢測 取出凍存的前額葉皮質腦組織，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE進行蛋白分離，恒流濕轉法冰上轉膜，BSA封閉，I抗孵育4℃過夜，PBST漂洗3次后加入相應II抗室溫孵育1 h，PBST漂洗后ECL發光顯影。

3.6 ELISA檢測 采用ELISA測定母鼠血清LBP和TNF-α及子代大鼠前額葉皮質中TNF-α和IL-10的含量，實驗步驟嚴格按照說明書操作。

3.7 組織免疫熒光染色 各組大鼠8周齡時行心臟灌注，將腦組織完整剝離放入4%多聚甲醛中固定，3 d后移入含30%蔗糖的4%多聚甲醛脫水，組織沉底后行冰凍切片。0.3%的Triton X-100打孔20 min，BSA封閉。I抗（抗IBA-1抗體，1∶500）4℃過夜。PBS漂洗3次后加入對應的熒光II抗，室溫避光孵育1 h，PBS室溫避光洗3次后，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片。在Nikon自動生物熒光顯微鏡下避光拍照。

3.8 行為學檢測

3.8.1 三箱社交實驗 采用透明塑料三箱，正式實驗前一天將大鼠依次從中間箱放入，讓其適應5 min。測試當天，陌生鼠箱放入一只同齡、同性別大鼠，玩具箱放入一個玩具，將被試大鼠再次從中間箱相同位置放入，ANY-maze軟件及配套攝像系統將自動記錄其在陌生鼠箱、玩具箱和中間箱的運動軌跡及時間，每只大鼠測試5 min。

3.8.2 嗅覺適應/去適應實驗 測試兩組大鼠對水、鼠尿和啤酒的興趣，采用一個干凈干燥的箱子作為觀察箱，被測大鼠放入觀察箱內，使其依次嗅含有水、鼠尿和啤酒3種液體的棉簽，每種棉簽依次更換3支，每只大鼠共嗅9支棉簽。每支棉簽觀察時間3 min，分別記錄測試大鼠嗅不同棉簽的總時間。

3.8.3 曠場實驗 使用長寬高為50 cm×50 cm×45 cm的黑色塑料箱，依次將被試大鼠從測試箱正中間放入，每只大鼠測試時間10 min。在ANY-maze軟件上將測試區域劃分為9個相等面積的正方形區域（1個中間區和8個周圍區），攝像系統記錄其運動軌跡和跨線數。觀看錄像記錄每只大鼠在箱內自梳理的時間。

3.9 細胞免疫熒光染色 將細胞爬片高溫消毒后加入24孔板中，在此接種上N9細胞，經TAK242處理及LPS刺激后去除原培養液，4%多聚甲醛固定，PBST（含0.2%的Triton X-100）打孔，BSA封閉。I抗［抗TLR4抗體（1∶100）、抗iNOS抗體（1∶250）及抗Arg-1抗體（1∶400）］4℃孵育過夜，PBS漂洗3次后加入對應的熒光II抗，室溫避光孵育1 h，PBS室溫避光洗3次后加入DAPI 20 min，清洗3次后取出蓋玻片，倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，Nikon熒光顯微鏡觀察。

4 統計學處理

利用GraphPad Prism軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 母鼠血清LBP及TNF-α水平變化

妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP濃度較PBS組顯著升高（P＜0.01），同時伴有炎癥因子TNF-α分泌水平顯著增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The levels of serum LBP（A）and TNF-α（B）in the pregnant rats with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖2 妊娠期不同處理組孕鼠血清LBP及TNF-α分泌水平

2 子代大鼠前額葉皮質TLR4和IBA-1的表達變化

妊娠期給予LPS處理后的仔鼠前額葉皮質中TLR4的mRNA和蛋白表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖3A、C；LPS組仔鼠前額葉皮質中IBA-1的mRNA和蛋白表達水平也較PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖3B、D。

3 子代大鼠前額葉皮質iNOS和Arg-1的表達變化

LPS組仔鼠前額葉皮質中iNOS的mRNA表達水平顯著高于PBS組（P＜0.05），而Arg-1的mRNA表達水平卻顯著低于PBS組（P＜0.05），見圖4A、B。同時Western blot結果顯示，LPS組iNOS的蛋白表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.05），而Arg-1的蛋白表達水平卻較PBS組降低（P＜0.01），進一步比較顯示，LPS組子代大鼠前額葉皮質中iNOS/Arg-1表達水平比值較PBS組顯著增加（P＜0.01），見圖4C。

4 子代大鼠前額葉皮質TNF-α及IL-10水平變化

ELISA結果顯示，LPS組仔鼠前額葉皮質TNF-α表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.01），而IL-10濃度卻較PBS組顯著降低（P＜0.01），見圖5A、B。

5 子代大鼠前額葉皮質小膠質細胞形態學變化

免疫熒光結果顯示，PBS組小膠質細胞的胞體濃縮，多向分支豐富且明顯，而LPS組的小膠質細胞分支消失，胞體增大、松散；統計分析每20個小膠質細胞內有分支的細胞數，結果表明LPS組具有分支的小膠質細胞數量顯著少于PBS組（P＜0.01），見圖5C。

6 行為學實驗

Figure 3.The mRNA（A，B）and protein（C，D）expression levels of TLR4（A，C）and IBA-1（B，D）in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖3 LPS組及PBS組子代大鼠前額葉皮質中TLR4和IBA-1表達水平的變化

三箱社交實驗中，LPS組仔鼠停留在陌生鼠箱的時間顯著低于PBS組（P＜0.01），而在玩具箱的時間卻顯著高于PBS組（P＜0.01）；嗅覺適應/去適應實驗分別比較兩組大鼠嗅蒸餾水、鼠尿和啤酒3種棉簽的時間，觀察到LPS組的子代大鼠嗅同齡陌生大鼠尿液的時間少于PBS組（P＜0.01），而嗅蒸餾水及啤酒的時間無顯著差異；曠場實驗中，LPS組仔鼠在測試中跨線數顯著低于PBS組（P＜0.01），同時LPS組仔鼠在曠場中自梳理毛發時間卻顯著高于對照組（P＜0.01），見表1。

7 TAK 242處理后LPS誘導的N9細胞TLR4、iNOS及Arg-1表達的變化

LPS組TLR4的mRNA表達水平顯著高于control及TAK242+LPS組（P＜0.01或P＜0.05），同時iNOS的mRNA表達水平較其它兩組也有顯著升高，但Arg-1的mRNA表達水平則顯著下降（P＜0.01），見圖6A。與LPS組相比，TAK242+LPS組的TLR4熒光強度顯著降低（P＜0.01），見圖6B。免疫熒光雙染觀察顯示，LPS組小膠質細胞中的iNOS高表達，以M1型為主，而TAK242+LPS組中則Arg-1高表達，以M2型為主；量化分析表明LPS組iNOS熒光強度顯著高于control組及TAK242組（P＜0.01），而Arg-1熒光強度則顯著降低（P＜0.01），進一步將iNOS/Arg-1比值進行比較，顯示LPS組iNOS/Arg-1比值顯著高于control及TAK242+LPS組（P＜0.01），見圖6C。

討 論

當妊娠期間免疫系統被激活時，再與其它遺傳和/或環境因素相結合，就有可能會增加特定神經發育障礙的發病風險，這一觀點已逐漸達成共識［14］。過去30年的流行病學研究證實，女性妊娠期暴露于感染、炎癥以及分娩時的高危因素均會增加子代神經發育性精神疾病（如精神分裂癥、孤獨癥）的風險［15］。此外，動物模型研究表明，懷孕期間母體過度免疫反應與子代生后大腦的變化及其行為發育存在密切的聯系［15］。孤獨癥兒童社會交流及交往障礙是最重要的癥狀，而嚙齒動物的社會交往問題主要表現為與同伴動物互動減少，對社會氣味（如鼠尿）［16］興趣降低，因此三箱社交實驗及嗅覺適應/去適應實驗是評估嚙齒動物社交能力的經典方法［17-22］。本研究中，我們觀察到孕鼠LPS暴露后其子代大鼠與同伴交流的興趣顯著低于PBS組，而對玩具的興趣卻顯著升高，同時對社會性氣味的興趣顯著減少，提示母鼠妊娠期LPS暴露增加了其仔鼠社會交往障礙的風險。孤獨癥另一癥狀為重復刻板性行為，這可以通過大鼠的自梳理行為來檢測［17-19］，同時大鼠在陌生環境中的活動和探索行為可以反映孤獨癥常伴有的焦慮等情緒問題［18-20］。曠場實驗結果顯示，妊娠期LPS暴露的仔鼠在陌生環境中的自主行為和探究行為減少，焦慮增加，而重復刻板行為增多。上述行為學結果表明妊娠期LPS暴露的母鼠所產仔鼠具有的孤獨癥樣行為與ASD兒童臨床表現基本一致。

Figure 4.The changes of iNOSand Arg-1 expression levels in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.A：the mRNA level of iNOS；B：the mRNA level of Arg-1；C：the protein levels of iNOSand Arg-1 and the ratio of iNOSto Arg-1.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖4 LPS組及PBS組子代大鼠前額葉皮質中iNOS和Arg-1表達水平的變化

人群研究結果表明，在LPS刺激下，ASD患兒血清TLR4表達及IL-1β、IL-6和TNF-α含量較正常對照組增加［23］，且IL-6及TNF-α的表達水平與孤獨癥核心癥狀及異常行為的嚴重程度呈正相關［24］。同時觀察到孤獨癥患者大腦尸檢標本中炎性細胞因子增加［7］，且免疫不耐受而導致的過敏、對疫苗過度反應、嚴重感染和未確診的自身免疫性疾病等在ASD患者中更常見［25］。這些證據均提示免疫功能異常可能與孤獨癥密切相關。在本研究的動物模型中，我們也觀察到了具有孤獨癥樣行為的大鼠腦組織內存在炎性細胞因子TNF-α增加、抗炎細胞因子IL-10減少、小膠質細胞激活等免疫異常現象，與上述人群中的研究結果相一致。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）表達在多種固有免疫細胞表面，在免疫激活過程中起著重要作用［26］。孕婦在妊娠期暴露于病原體或未知的損傷信號時，通過TLRs信號通路，特別是TLR4 信號通路，誘導先天免疫反應［27-28］。LPS 是TLR4的特異性配體，通過LBP介導與CD14的結合，激活TLR4/NF-κB信號通路，參與炎癥應答［29］。在本研究中，妊娠期腹腔注射LPS后，母鼠血清LBP及TNF-α表達均較PBS組升高，同時仔鼠前額葉皮質中TLR4表達水平也顯著升高，表明妊娠期LPS處理激活了母鼠免疫反應及子代大鼠腦組織中TLR4信號通路。TLR4在腦組織中主要表達于小膠質細胞，它參與了小膠質細胞介導的炎癥反應，并導致IL-1β、TNF-α、iNOS等的產生和分泌［8］。有研究顯示，使用TLR4信號通路抑制劑TAK242可抑制膿毒癥腦病小鼠腦內小膠質細胞的活化，從而改善小鼠的學習記憶功能［30］。本研究中，我們觀察到母鼠孕期LPS暴露后仔鼠前額葉皮質內小膠質細胞的數量增多，并伴有促炎細胞因子TNF-α分泌增加及抗炎細胞因子IL-10分泌減少，結合仔鼠前額葉皮質內TLR4表達增加，推測LPS誘導的MIA模型可能通過子代TLR4信號通路激活了前額葉皮質內的小膠質細胞。

Figure 5.The changes of TNF-α（A）and IL-10（B）levels and observation of microglial branches（C）in the prefrontal cortex of pups in PBSgroup and LPSgroup.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=4.**P＜0.01 vs PBSgroup.圖5 不同處理組仔鼠前額葉皮質中TNF-α和IL-10的表達及小膠質細胞分支的觀察

表1 妊娠期不同處理仔鼠成年期相關行為學測試Table 1.The associated behavior tests of the pups treated by different challenge during gestation period（Mean±SD.n=14）

Figure 6.The changes of TLR4，iNOSand Arg-1 expression levels in the N9 cells induced by LPSafter TAK242 treatment.A：the mRNA levels of TLR4，iNOSand Arg-1 in the N9 cells；B：the immunofluorescence staining of TLR4 in the N9 cells；C：the immunofluorescence observation of iNOSand Arg-1 in the N9 cells.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPSgroup.圖6 TAK 242處理后LPS誘導的N9細胞中TLR4、iNOS及Arg-1表達的變化

小膠質細胞是中樞神經系統中的主要免疫細胞，是中樞神經系統損傷及免疫激活的第一道防御［4］。小膠質細胞參與突觸修剪，清除功能異常的突觸以保持大腦的正常功能［31］。Rodriguez等［32］的研究顯示，ASD患者存在突觸修剪錯誤，小膠質細胞參與了ASD的發病。Morgan等［33］將ASD患者死后大腦用小膠質細胞標志物（IBA-1和HLA-DR）進行免疫染色，觀察到ASD患者額葉島葉及背外側前額葉皮層、視覺皮層及小腦中被激活的小膠質細胞數量增加，同時在背外側前額葉皮層小膠質細胞存在空間結構異常。Edmonson等［34］也觀察到在ASD患者前額葉皮質及小腦中存在神經膠質細胞異常激活。這些大量的研究證據表明，小膠質細胞活性與ASD密切相關。小膠質細胞具有巨大的形態和功能可塑性［35］，中樞神經系統中的小膠質細胞被激活后，表現為分支回縮，由高分化的薄胞體轉變為分支較少的阿米巴樣細胞［36-38］。本研究顯示，在具有孤獨癥樣行為的大鼠腦組織中不僅檢測到前額葉皮質內IBA-1表達水平顯著升高，同時觀察到小膠質細胞分支消失，胞體增大、松散，而且PBS對照組的小膠質細胞胞體呈濃縮狀態，多向分支豐富明顯，進一步表明妊娠期LPS暴露激活了子代大鼠前額葉皮質中的小膠質細胞。被激活的小膠質細胞存在M1和M2兩種表型，M1表型是經典的活化類型，可誘導IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS分泌，引起細胞死亡或組織損傷。而M2型包括選擇性激活和獲得性失活兩種狀態，前者可分泌IL-4和IL-13，具有抗炎及促進組織修復的作用，后者可攝取凋亡細胞或促進抗炎細胞因子IL-10及TGF-β分泌，減輕急性炎癥反應［5］。有趣的是，我們的研究也檢測到妊娠期LPS暴露使子代ASD樣大鼠前額葉皮質中M1型小膠質細胞標志物iNOS表達顯著增加，而M2型小膠質細胞標志物Arg-1表達顯著減少，從而導致M1/M2比例失衡，結合LPS組前額葉皮質TNF-α含量升高、IL-10降低的結果，進一步表明妊娠期LPS暴露可導致子代大鼠前額葉皮質小膠質細胞向M1型極化，促進炎性細胞因子分泌，減少抗炎細胞因子產生。

TAK242為TLR4的特異性抑制劑，可下調TLR4下游信號分子MyD88和TRIF的表達［39］。而在體外實驗中，我們觀察到TAK242預處理可抑制LPS誘導的小膠質細胞向M1型的轉變，證明小膠質細胞的分型極化依賴于TLR4信號通路的激活，但TLR4信號通路如何調控小膠質細胞極化的分子機制，還有待于我們今后的深入研究。

綜上所述，我們的研究顯示，母鼠妊娠期LPS暴露引起的MIA可上調子代前額葉皮質中TLR4表達水平，誘導小膠質細胞異常活化，即向M1型極化，引起M1/M2比例失衡，促進炎性細胞因子分泌，而抗炎性細胞因子減少。這可能是引起子代大鼠產生孤獨癥樣行為的一個致病因素，也為我們下一步研究提供了一定的實驗基礎。