鈣蛋白酶2及自噬相關蛋白5對內質網應激誘導的肝細胞凋亡的影響*

陳雨絲，韓 冰，鄭 璐，蔡 爽，湯 雷，楊 毅，郭怡歆，梁 猜， 趙金有， 楊 婷， 楊 勤， 謝汝佳

（貴州醫科大學貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，基礎醫學院病理生理學教研室，貴州貴陽550025）

細胞凋亡（apoptosis）屬于程序性細胞死亡的方式之一，是通過激活特定的信號通路、受到嚴格控制的細胞主動死亡的過程。細胞凋亡在維持機體穩態和保證組織器官正常生理功能中具有重要意義，但是如果細胞凋亡過度也會導致疾病的發生［1］。且內質網作為真核細胞重要的膜性細胞器，對細胞的調控起著非常重要的作用，一旦如饑餓、Ca2+平衡紊亂、氧化應激等有害因素侵襲時，內質網的穩態被打破，大量的未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白累積在內質網腔內，從而導致內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）發生，而ERS一旦持續或加重，就會誘導細胞發生凋亡［2］。因此，ERS時，細胞為了對抗一系列有害因素的侵襲會啟動其它的蛋白質降解途徑來對其內質網腔內堆積的未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白進行降解，從而恢復內質網的穩態［3］。近年來的研究證明，自噬（autophagy）作為真核生物細胞內除泛素-蛋白酶體降解系統的另一種蛋白質降解系統，參與了對未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白的降解過程，而自噬相關蛋白5（autophgy-related protein 5，Atg5）可與Atg12結合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統，再和外膜結合以促進自噬體膜的延伸，最后形成自噬體，因此Atg5在自噬形成初期起著重要重要作用［4］。

鈣蛋白酶（calpain）是鈣依賴性的半胱氨酸蛋白酶，廣泛分布于絕大多數哺乳動物組織中。calpain-2是calpain超家族的主要成員之一。有研究表明，calpain-2可能通過水解Atg5，從而在轉錄后水平上對Atg5的表達進行調控［5］。然而在肝細胞中calpain-2與Atg5之間的相互關系以及對肝細胞凋亡的影響卻未見有報道。本研究采用二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）處理體外培養的大鼠正常肝細胞BRL-3A，誘導細胞發生ERS，觀察calpain-2及Atg5對肝細胞凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

大鼠正常肝細胞BRL-3A（中國科學院典型細胞培養物保藏中心上海細胞庫）；DMEM培養基和胎牛血清（Gibco）；胰酶、彩虹Marker、BCA蛋白定量試劑盒和DTT（北京索萊寶科技有限公司）；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒（Thermo）；兔抗β-actin抗體、兔抗Atg5抗體、兔抗Atg7抗體和兔抗微管相關蛋白1輕鏈 3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（Abcam）；兔抗calpain-2抗體（Thermo）；Protein G瓊脂糖微珠（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 細胞培養 用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養基培養BRL-3A細胞，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，2～3 d換液1次，細胞密度達85～90%時以1∶3傳代備用。

2.2 多功能實時無標記細胞分析儀（real-time cell analysis，RTCA）檢測不同濃度的DTT對BRL-3A細胞增殖的影響 RTCA DP系統可通過E-plate底部的電極檢測貼壁細胞的電阻抗，來反應細胞的數量、形態、活力以及貼壁的情況，將細胞指數（cell index，CI）作為檢測指標。取處于對數生長期的細胞，用含EDTA胰酶消化后制成細胞懸液再進行細胞計數，以每孔7×103個細胞接種于E-plate，等細胞貼壁后再分別加入終濃度為0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L和6.0 mmol/L的DTT處理BRL-3A細胞，每個濃度設置3個復孔，連續動態檢測60 h，觀察不同濃度的DTT對BRL-3A細胞增殖的影響，每10 min記錄1次，最后采用RTCA軟件來分析獲得CI值并篩選出后續實驗的最佳藥物濃度。

2.3 ERS細胞模型的建立 根據RTCA實驗結果，使用終濃度為2.0 mmol/L的DTT誘導BRL-3A細胞發生ERS，處理時間分別為0 h、6 h、12 h和24 h，收集細胞樣本用于real-time PCR、Western blot、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）及流式細胞術檢測。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞處理方法同2.3。用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，收集各組細胞至離心管中，2 000 r/min離心5 min后棄上清，然后用預冷的PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min各2次。加入500μL的binding buffer懸浮細胞，每一組細胞中加入5μL的annexin V-FITC混勻，再加入5μL的PI混勻，室溫下避光反應10～15 min，上流式細胞儀檢測。

2.5 流式細胞術檢測細胞周期 細胞處理方法同2.3。用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組細胞，收集各組細胞至離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，再以預冷的PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，棄上清后各組加入500μL無水乙醇固定4℃過夜，次日1 000 r/min離心3～5 min，棄掉無水乙醇，再以PBS洗滌后1 000 r/min離心3～5 min，棄上清。配制PI/RNase A染色工作液，各組分別加入工作液500μL，混勻后避光反應30～60 min，上流式細胞儀檢測。

2.6 real-time PCR法檢測calpain-2和Atg5的mRNA表達水平 將每組細胞用PBS洗滌2次，再加入1.0 mL的TRIzol裂解液置于冰上裂解10 min，收集細胞裂解液提取RNA，用核酸蛋白儀測定RNA濃度，并根據A260/A280的比值確定所提取的RNA的純度，且所有樣本的A260/A280的比值均在1.8～2.0范圍內則符合實驗要求。按照Thermo K1622逆轉錄試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系：5×reaction buffer 4μL，dNTP Mix 2μL，Oligo dT 1μL，RNase inhibitor 1μL，transcriptase 1μL，RNA樣品為含1μg RNA的體積，RNase-free H2O補足反應體系。反應條件為：25℃10 min，48℃ 60 min，95℃ 5 min。逆轉錄后合成的cDNA保存在-4℃短期內使用。然后按照說明書配制實時熒光定量PCR反應體系：2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA模板2μL，RNase-free H2O 8.5μL，總體積25 μL。反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。實驗所用的引物序列見表1。

2.7 Western blot法檢測calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和LC3的蛋白水平變化 收集各組細胞，分別加入120μL細胞裂解液，置于冰上裂解10 min，收集細胞懸液于4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清。BCA工作法進行蛋白定量，以40μg總蛋白上樣然后進行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min。將兔抗calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12和LC3抗體用I抗稀釋液按照說明書上的比例稀釋后與PVDF膜置于4℃搖床孵育過夜，次日用TBST洗膜3遍后再與II抗（1∶4 000）室溫孵育60 min，TBST洗膜3遍，ECL發光成像，βactin作為內參照，用Image Lab圖像分析軟件對樣本每一個條帶的灰度值進行半定量分析。

表1 Real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.8 Co-IP法檢測calpain-2與Atg5之間的相互作用關系 將細胞隨機分為對照組和DTT組，DTT組采用終濃度為2.0 mmol/L DTT處理24 h，對照組則加入等體積PBS處理24 h。棄培養基，PBS洗滌1次，每皿加入500μL裂解液，冰上裂解10 min。用細胞刮分別收集至1.5 mL的EP管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清至新的EP管中，BCA工作法定量，將抗體按免疫共沉淀所需1∶50比列添加至200 μL濃度為1 g/L的裂解物中，4℃旋轉孵育過夜。次日，加入Protein G瓊脂糖微珠各20μL，4℃旋轉孵育3 h后，4℃、10 000 r/min離心1 min，棄上清，800μL洗滌液洗滌沉淀5次，然后分別加入2×上樣緩沖液20 μL，渦旋震蕩后14 000×g瞬時離心30 s，樣品加熱至 95～100℃，5 min后14 000×g離心 1 min，進行Western blot。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5統計軟件進行數據分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組之間比較則采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 RTCA動態監測不同濃度的DTT對BRL-3A細胞增殖的影響

與0 mmol/L DTT組相比，0.5 mmol/L DTT和1.0 mmol DTT對BRL-3A細胞增殖并沒有明顯的抑制作用，而2.0 mmol/L DTT對細胞增殖有明顯的抑制作用（P＜0.05），且隨著濃度的增加，DTT對細胞增殖的抑制作用更明顯，見圖1。

Figure 1.Dynamic monitoring of the normalize cell index of the BRL-3A cells treated with DTTat different concentrations by xCELLigence RTCA system（A），and the viability of BRL-3A cells exposed to DTTat different concentrations for 24 h（B）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 mmol/L group.圖1 xCELLigence RTCA系統動態監測不同濃度DTT處理的BRL-3A細胞的標準化細胞指數

2 流式細胞術檢測BRL-3A細胞凋亡情況

流式細胞術檢測發現，2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細胞0 h、6 h、12 h和24 h后，0 h組細胞凋亡率為（4.41±3.41）%，6 h組細胞凋亡率為（2.70±6.76）%，DTT作用時間延長后，12 h組細胞凋亡率為（12.13±7.19）%，24 h組的細胞凋亡率為（22.71±19.25）%，細胞凋亡率隨著DTT作用時間延長進一步增加（P＜0.05），見圖2。

3 流式細胞術檢測BRL-3A細胞的細胞周期分布

流式細胞術檢測細胞周期發現，DTT 6 h、12 h和24 h組的細胞周期分布與0 h組相比均發生明顯變化，細胞周期均被阻滯在G1期，且S期及G2/M期細胞比例明顯下降，見圖3及表2。

4 Real-time PCR檢測calpain-2和Atg5的mRNA表達變化

Real-time PCR結果顯示，與0 h組比較，DTT處理BRL-3A細胞6 h后，calpain-2和Atg5的mRNA水平表達增加，且DTT處理BRL-3A細胞12 h后mRNA表達水平達到最高；DTT處理BRL-3A細胞24 h后，calpain2和Atg5的mRNA表達水平雖較12 h有所下降，但仍然明顯高于 0 h組和 6 h組（P＜0.05），見圖4。

5 DTT 處理 BRL-3A 細胞后 calpain-2、Atg5、Atg7、Atg12及LC3的蛋白表達變化

Western blot檢測結果顯示，與0 h組相比，DTT處理細胞6 h、12 h和24 h后Atg12、Atg7及calpain-2蛋白表達水平逐漸升高（P＜0.05），LC3的蛋白表達較0 h組明顯增加，且LC3-II/LC3-I的比值也較0 h組顯著增大（P＜0.05），而Atg5的蛋白表達水平逐漸降低（P＜0.05），見圖5。

6 Co-IP檢測calpain-2和Atg5的相互作用

2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細胞24 h后，用抗Atg5的抗體不僅能夠在細胞裂解物中檢測到Atg5的存在，并且也能檢測到calpain-2的存在，而對照組僅能檢測到Atg5的存在；用抗calpain-2抗體進行反向Co-IP發現，在DTT處理24 h的細胞裂解物中不僅能檢測到calpain-2的存在，同時也能檢測到Atg5的存在，而對照組僅能檢測到calpain-2的存在，見圖6。由此可以說明，在DTT誘導肝細胞發生ERS的過程中，calpain-2和Atg5存在相互作用關系。

Figure 2.The effect of DTTtreatment on the apoptosis of BRL-3A.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 h group.圖2 DTT處理后對BRL-3A細胞凋亡的影響

Figure 3.The effect of DTTtreatment on the cell cycle of BRL-3A cells.圖3 DTT處理BRL-3A細胞后對細胞周期的影響

表2 DTT對BRL-3A細胞周期分布的影響Table 2.Effect of DTTtreatment on the cell cycle distribution of BRL-3A cells（%.Mean±SD.n=3）

討 論

肝細胞凋亡是調節肝組織正常細胞更新、增殖及再生的重要機制，同時也是造成肝臟損傷以及肝臟疾病的關鍵環節。肝細胞凋亡過度會導致各種肝臟疾病的發生，例如肝功能衰竭、肝纖維化等。因此，深入研究肝細胞凋亡的機制對臨床肝臟疾病的防治具有重要意義［8-10］。

Figure 4.The mRNA expression of calpain-2 and Atg5 after DTT stimulation.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 h group.圖4 Real-time PCR檢測DTT處理細胞后calpain-2和Atg5的mRNA表達

ERS信號通路是繼死亡受體通路和線粒體通路后新發現的一條細胞凋亡信號通路。ERS時，細胞通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR），一方面使細胞周期停滯在G1/S期，另一方面可抑制蛋白質的合成以減輕蛋白質在內質網中的聚集；此外，還可通過激活內質網相關蛋白降解系統對內質網中聚集的蛋白質進行清除。通過上述一系列信號轉導途徑可以減輕或終止ERS，從而恢復細胞內環境穩態。但是ERS如果持續存在或加重，超過細胞自身代償能力時也可誘發細胞凋亡［2，9］。

Figure 5.The protein levels of Atg5，calpain-2，Atg12，Atg7 and LC3 in the BRL-3A cells exposed to 2.0 mmol/L DTT at different time points.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs0 h group.圖5 2.0 mmol/L DTT處理BRL-3A細胞不同時間對Atg5、calpain-2、Atg12、Atg7和LC3蛋白水平的影響

Figure 6.Co-IPdetection of the interaction between Atg5 and calpain-2 in the BRL-3A cells treated with DTT.圖6 Co-IP檢測DTT處理BRL-3A細胞后Atg5與calpain-2之間的相互作用

課題組前期研究發現，采用2.0 mmol/L DTT處理體外培養的肝細胞6、12和24 h后，ERS信號通路中相關信號分子GRP78、p-PERK、ATF4和CHOP的表達水平顯著上調，說明2.0 mmol/L DTT處理細胞能夠誘導ERS的發生［9］，因此在本次實驗中仍然采用2.0 mmol/L DTT處理細胞。流式細胞術檢測發現，DTT處理細胞6、12和24 h后，G1期細胞較對照組（0 h組）顯著增加，說明DTT處理細胞后細胞周期被阻滯在G1期。此外，Western blot檢測發現，DTT處理細胞不同時間后，自噬相關指標Atg12、Atg7和LC3蛋白表達水平均較0 h組顯著上調，且LC3-II/LC3-I的比值也較0 h組明顯增大。由于LC3有LC3-I和LC3-II兩種形式，隨著自噬的發生，LC3-I與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合而轉變為LC3-II；當自噬泡膜閉合時，只有LC3-II定位于自噬泡膜上，因此LC3-I向LC3-II的轉化可作為自噬發生的標志。自噬作為真核生物細胞內除泛素-蛋白酶體降解系統外的另一種蛋白質降解系統，廣泛參與了ERS時對內質網腔中聚集的蛋白質的降解過程［4］。因此，ERS時自噬水平增高可能是細胞的一種重要代償保護機制，可在一定程度上減輕ERS，從而發揮保護肝細胞的作用［7］。上述研究結果提示，DTT誘導肝細胞發生ERS時，細胞通過啟動UPR，一方面阻止細胞進入細胞周期，另一方面通過增強細胞內蛋白質降解系統（上調細胞自噬水平）對聚集在內質網中的蛋白質進行清除，以求恢復細胞穩態。但是本研究也發現，DTT處理細胞不同時間后，細胞凋亡較對照組（0 h組）顯著增多，呈明顯的時間依賴性，提示可能還有其他信號通路參與了對ERS的調控。

在本次研究中還觀察到一個有趣的現象，當DTT誘導肝細胞發生ERS后，與Atg12、Atg7和LC3的蛋白表達變化不同，Atg5的蛋白表達水平較對照組（0 h組）顯著降低。Atg5是在自噬體形成過程中發揮關鍵作用的蛋白質，它可與Atg12結合，形成Atg5-Atg12泛素樣連接系統，再和外膜結合以促進自噬體膜的延伸，最后形成自噬體［10-14］。由此可見，Atg5在自噬過程中發揮了重要作用。為了進一步明確Atg5蛋白水平的下調是發生在轉錄水平還是轉錄后水平，我們進一步對Atg5的mRNA表達進行了檢測。結果發現DTT處理細胞后，Atg5的mRNA水平較對照組（0 h組）顯著升高，提示Atg5蛋白水平降低可能發生在轉錄后水平。

近年來有研究發現，calpain家族成員calpain-2可能參與了對Atg5轉錄后水平的調控［15-16］。calpain-2是細胞內的一種蛋白水解酶，可通過水解多種底物蛋白參與疾病的發生發展過程，這其中可能也包括對Atg5的水解。例如Yousefi在研究中發現，calpain-2可能通過水解Atg5，從而在轉錄后水平上對Atg5的表達進行調控［15］。為了證實在肝細胞中是否也存在這一調控過程，本研究進一步檢測了細胞中calpain-2的mRNA及蛋白表達含量，結果發現，DTT處理細胞后，calpain-2的mRNA及蛋白表達水平均顯著上調。這提示當肝細胞發生ERS時，Atg5蛋白水平的降低可能與calpain-2的表達增多有關。為證實這一猜測，我們采用Co-IP的方法對Atg5與calpain-2的相互作用關系進行了研究。結果證實，DTT處理細胞24 h后，利用calpain-2抗體能夠將calpain-2蛋白及與其發生相互作用的Atg5蛋白共同沉淀下來；反之，利用Atg5抗體也能夠將Atg5蛋白及與其發生相互作用的calpain-2蛋白共同沉淀下來，而在對照組則未檢測到這一現象。上述研究結果提示，肝細胞發生ERS時，calpain-2蛋白與Atg5蛋白之間的確發生了相互作用，而Atg5蛋白水平的降低可能與calpain-2、Atg5之間的相互作用并對Atg5進行水解有關。由于Atg5是自噬體形成過程中的關鍵蛋白，其表達減少將影響自噬體的形成，導致細胞自身代償機制不充分，從而使肝細胞走向凋亡。在后續實驗中我們將進一步采用calpain-2和Atg5的免疫熒光共定位以及calpain-2抑制劑等方法來進一步驗證兩者之間的相互關系。