白頭翁皂苷A通過調控miR-24-3p/RNF2的表達影響乳腺癌細胞增殖及放射敏感性*

鄒曉靜， 郝燕燕△， 胡一迪， 謝燊俠， 白 薇

（溫州市中醫院 1檢驗科，2甲乳外科，浙江溫州325000）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前治療主要 以手術結合放化療為主，但化療易耐藥及放射不敏感是困擾臨床的重要問題［1］，因此尋找有效治療乳腺癌的藥物及增強放化療敏感性的藥物是目前研究的重點。研究表明，中藥治療乳腺癌具有毒副作用小、效果好等特點，對乳腺癌的預防效果顯著，且一些中藥對腫瘤細胞具有放療增敏的效果［2］。白頭翁是一種中草藥，具有抗腫瘤、抗氧化及促進免疫等作用［3］。且研究報道白頭翁皂苷D體外可誘導肺腺癌細胞凋亡［4］；白頭翁皂苷A（Pulsatilla saponin A）可抑制人非小細胞肺癌的生長，增強腫瘤細胞放射敏感性［5］。此外，微小RNA（microRNA，miRNA，miR）也與腫瘤的發展和放療敏感性相關，如miR-24-3p可增強鼻咽癌細胞的放射敏感性［6］，miR-24-3p可促進乳腺癌細胞增殖和侵襲［7-8］。然而白頭翁皂苷A在體外對乳腺癌細胞增殖及放射敏感性的影響還尚未見報道。因此，本研究擬探討白頭翁皂苷A對人乳腺癌MCF-7細胞放射敏感性的影響及其機制是否與miR-24-3p有關。

材料和方法

1 材料與試劑

人乳腺癌MCF-7細胞購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清和DMEM培養液（Gibco）；RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒（TaKaRa）；Taq DNA Polymerase和AceQ qPCR SYBR?Green Mix（Vazyme）；LipofectamineTM2000轉染試劑盒（Invitrogen）；MTT、蛋白提取試劑盒和BCA試劑盒（上海碧云天公司）；白頭翁皂苷A（湖北萬得化工有限公司）；miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p載體質粒（上海吉瑪生物公司）。［60Co］醫療照射裝置（中國核動力研究院）。

2 白頭翁皂苷A儲存液的配制

稱取白頭翁皂苷A 0.668g，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液33.4 mL，配成濃度為20 mg/L的儲存液，攪拌均勻后，抽濾無菌培養，-20℃避光保存，使用時按所需濃度按比例稀釋。

3 方法

3.1 細胞培養 MCF-7細胞常規培養于含10%FBS的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養。每2～3 d傳代一次。

3.2 細胞轉染和分組 參考彭超軍［5］的實驗方法，取對數生長期細胞消化后，接種于96孔板（每孔1×104個）培養，DMEM培養液培養24 h后，吸去原培養液，換成終濃度分別為0、5、10、15和20 mg/L的白頭翁皂苷A的DMEM培養液，記為不同濃度白頭翁皂苷A處理組。不添加白頭翁皂苷A的作為對照組，以終濃度為10 mg/L的白頭翁皂苷A培養MCF-7細胞，記作白頭翁皂苷A組。

取常規培養的乳腺癌MCF-7細胞消化后接種于6孔板中，待細胞生長至80%融合，更換為無血清培養液同步化12 h，隨后進行轉染。將miR-NC、miR-24-3p、anti-miR-NC和anti-miR-24-3p質粒分別轉染至乳腺癌MCF-7細胞中，記為miR-NC組、miR-24-3p組、anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組，轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

取部分anti-miR-NC組和anti-miR-24-3p組的細胞分別加10 mg/L的白頭翁皂苷A培養48 h，記為白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組和白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組。

3.3 MTT法測定白頭翁皂苷A對乳腺癌MCF-7細胞活力的影響 取以上各組細胞，在其培養至48 h時每孔加入20μL質量濃度為5 g/L的MTT試劑，繼續孵育4 h，加入150μL的DMSO，震蕩混勻，在酶標儀測定各孔吸光度（A450）值。實驗重復3次，每組設3個復孔取均值，將對照組細胞抑制率設定為0%。其余各組細胞抑制率（%）=（1-實驗組A/空白對照組A）×100%。

3.4 集落形成實驗 取對照組、白頭翁皂苷A組、白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組、白頭翁皂苷A+antimiR-24-3p組、miR-NC組和miR-24-3p組細胞，分別給予0、2、4、6和8 Gy的［60Co］照射。照射后，按照射劑量大小分別以 0.3×103、1×103、1×103、3×103和 3×103的細胞密度接種于60 mm的培養皿中，繼續培養10～14 d。PBS清洗2遍后甲醇固定15 min，吉姆薩染色30 min，在低倍光學顯微鏡下計數＞50個細胞的集落。平板效率（plating efficiency，PE；%）=集落數/接種細胞數×100%。存活分數（survial fraction，SF）=照射劑量組集落數（/該組細胞接種數×未照射組PE）。采用多靶單擊模型擬合細胞存活曲線，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×ln N。其中D為照射劑量（Gy），D0為平均致死劑量，Dq為準閾劑量（代表存活的寬肩度），N為外推值。放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）=單純照射組D0/加藥聯合照射組D0。

3.5 RT-qPCR分析miR-24-3p和環指蛋白2（ring finger protein 2，RNF2）的mRNA表達水平 按照TRIzol說明書提取總RNA，用反轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，按照AceQqPCR SYBR?Green Mix說明書進行RT-qPCR擴增。循環條件為：95℃30 s，60℃30 s，72℃ 30 s，共40個循環；60℃延長5 min。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。實驗均重復3次，每次設3個復孔。

3.6 Western blot檢測RNF2蛋白表達 提取各組細胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。各組蛋白上樣量60μg，SDS-PAGE后，經電轉將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應的Ⅰ抗，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；再加入相對應的Ⅱ抗室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影，定影。采用Quantity One凝膠分析軟件處理，測定各組蛋白條帶的A值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達水平。實驗均重復3次，每次設3個復孔。

3.7 螢光素酶報告基因實驗檢測miR-24-3p對RNF2的靶向調控 TargetScan數據庫顯示RNF2的3′-UTR有miR-24-3p的結合位點。構建野生型和突變型RNF2的3′-UTR螢光素酶表達載體（WT-RNF2和MUT-RNF2），取對數生長期MCF-7細胞接種于24孔板（每孔1×103個），待細胞生長至80%融合時，用LipofectamineTM2000將WT-RNF2和MUT-RNF2質粒分別轉染細胞，同時分別轉染miR-24-3p和miR-NC。依據說明書要求，使用螢光素酶報告基因檢測儀進行雙螢光素酶報告基因實驗。實驗結果以螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性的比值進行統計學分析。實驗重復3次，每次設3個復孔。

4 統計學處理

采用GraghPad Prism 5擬合細胞存活曲線。采用SPSS 20.00進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度的白頭翁皂苷A對MCF-7細胞活力的影響

用不同濃度的白頭翁皂苷A處理乳腺癌MCF-7細胞48 h后，乳腺癌MCF-7細胞的活力抑制率隨著白頭翁皂苷A的濃度升高而顯著升高（P＜0.05），見表1。白頭翁皂苷A的濃度為10 mg/L時，細胞活力抑制率為50%左右，因此我們將10 mg/L作為后續實驗用藥濃度。

2 白頭翁皂苷A對MCF-7細胞放療敏感性的影響

集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，在MCF-7細胞中對照組和白頭翁皂苷A組的D0值分別是2.846和1.517，白頭翁皂苷A的SER是1.876，見表2。細胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，白頭翁皂苷A聯合照射組的SF小于單純照射對照組，存活曲線下移（P＜0.05），見圖1。

表1 不同濃度的白頭翁皂苷A對MCF-7細胞活力的影響Table 1.Effect of different concentrations of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

表2 對照組和白頭翁皂苷A組的多靶單擊模型參數Table 2.The parameters of multitarget single-hit model in control and Pulsatilla saponin A groups.

Figure 1.Survival curve of MCF-7 cells after different doses of irradiation.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group.圖1 不同劑量照射后MCF-7細胞的存活曲線

3 白頭翁皂苷A對MCF-7細胞中miR-24-3p和RNF2表達的影響

相較于對照組，白頭翁皂苷A組中miR-24-3p的表達水平顯著升高，RNF2的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖2、表3。

4 miR-24-3p靶向調控RNF2的表達

Figure 2.RNF2 protein electropherogram of control and Pulsatilla saponin A groups.圖2 對照組和白頭翁皂苷A組的RNF2蛋白電泳圖

表3 白頭翁皂苷A對MCF-7細胞中miR-24-3p和RNF2表達的影響Table 3.Effect of Pulsatilla saponin A on expression of miR-24-3p and RNF2 in MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

通過TargetScan數據庫預測到RNF2與miR-24-3p存在結合位點，見圖3A。螢光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染WT-RNF2的MCF-7細胞中，miR-24-3p組的螢光素酶活性較于miR-NC組顯著降低（P＜0.05）；而轉染MUT-RNF2的細胞中，兩組的螢光素酶活性無顯著差異，見表4。相較于miR-NC組，miR-24-3p組MCF-7細胞中RNF2蛋白的表達顯著降低；而相較于anti-miR-NC組，anti-miR-24-3p組MCF-7細胞中RNF2蛋白的表達顯著升高（P＜0.05），見圖3B及表5。*P＜0.05vsmiR-NCgroup.*P＜0.05vsmiR-NCgroup；#P＜0.05vsanti-miR-NCgroup.

Figure 3.miR-24-3p targeted RNF2 and regulated its expression.A：the 3′UTRof RNF2 contains a nucleotide sequence complementary to miR-24-3p；B：RNF2 protein electropherogram.圖3 miR-24-3p靶向調控RNF2的表達

表4 雙螢光素酶報告基因實驗結果Table 4.The results of dual-luciferase reporter assay（Mean±SD.n=9）

表5 miR-24-3p調控RNF2蛋白的表達Table 5.miR-24-3p regulated the expression of RNF2 protein（Mean±SD.n=9）

5 miR-24-3p過表達對MCF-7細胞增殖和放療敏感性的影響

相較于miR-NC組，miR-24-3p組MCF-7細胞中miR-24-3p的表達水平顯著升高（P＜0.05），且細胞活力的抑制率顯著升高（P＜0.05），見表6。集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，miR-NC組和miR-24-3p組的D0值分別是2.267和1.370，miR-24-3p過表達的SER是1.655，見表7。細胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，miR-24-3p組的SF顯著小于miR-NC組，存活曲線顯著下移（P＜0.05），見圖4。

表7 miR-NC組和miR-24-3p組的多靶單擊模型參數Table 7.The parameters of multitarget single-hit model in miRNCand miR-24-3p groups

6 抑制miR-24-3p表達逆轉了白頭翁皂苷A對MCF-7細胞增殖和放療敏感性的作用

相較于白頭翁皂苷A+anti-miR-NC組，白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組MCF-7細胞中miR-24-3p表達水平顯著降低（P＜0.05），RNF2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），且細胞活力的抑制率顯著降低（P＜0.05），見圖5及表8。

Figure 4.Effect of miR-24-3p overexpression on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group.圖4 miR-24-3p過表達對MCF-7細胞放射敏感性的影響

Figure 5.RNF2 protein electropherogramof different groups.圖5 各組RNF2蛋白電泳圖

表8 抑制miR-24-3p表達逆轉了白頭翁皂苷A對MCF-7細胞活力的作用Table 8.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on viability of MCF-7 cells（Mean±SD.n=9）

集落形成實驗后，通過多靶單擊模型擬合計算得出，白頭翁皂苷A組和白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SER分別是1.766和0.603，見表9。細胞存活擬合曲線顯示，在同一劑量照射下，白頭翁皂苷A+anti-miR-24-3p組的SF大于白頭翁皂苷A+antimiR-NC組，存活曲線上移（P＜0.05），見圖6。

討 論

近年來研究表明，中醫藥可以減輕放化療帶來的毒副反應，且可提高腫瘤細胞的放射敏感性［9］。中藥白頭翁中提取的有效成分皂苷具有體外抗腫瘤作用［10］，如白頭翁皂苷A可以通過調控Bcl-2、cyclin B1等蛋白的表達促進多發性骨髓瘤細胞凋亡［11］。在急性白血病中，白頭翁皂苷A可誘導K562細胞向紅系分化；還可誘導急性髓系白血病細胞系（K562、U937及HL-60細胞）及其原代細胞向更成熟的粒系分化［12］。白頭翁皂苷A可增強人非小細胞肺癌細胞的放射敏感性［5］。白頭翁皂苷D通過抑制AKT/mTOR信號通路可抑制結腸癌腫瘤的血管生成，誘導細胞凋亡［13］；而抑制PI3K通過降低AKT活性可提高MCF-7細胞對放射的敏感性［14］。以上結果表明，白頭翁皂苷不僅具有抗腫瘤作用，還能增加癌細胞對輻射的敏感性。本實驗結果顯示，白頭翁皂苷A可抑制乳腺癌細胞增殖，且增強了乳腺癌細胞的放射敏感性。與先前研究報道相符。

表9 各組多靶單擊模型參數Table 9.The parameters of multitarget single-hit model in different groups

Figure 6.Inhibition of miR-24-3p expression reversed the effect of Pulsatilla saponin A on radiosensitivity of MCF-7 cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Pulsatilla saponin A+anti-miR-NCgroup.圖6 抑制miR-24-3p表達逆轉了白頭翁皂苷A對MCF-7細胞放射敏感性的作用

miRNA不僅參與腫瘤細胞的惡性生物學行為，還與細胞放射敏感性相關。miR-24-3p在膀胱癌、結腸癌等多種腫瘤組織中下調表達，過表達可以抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲［15-16］。miR-24-3p通過靶向SOX7促進肺癌中的細胞遷移和增殖［17］。miR-24-3p通過靶向下調PRKCH可抑制腺樣囊性癌細胞的活力、增殖、遷移、侵襲等［18］。過表達miR-24通過靶向SP1能增強鼻咽癌的放射敏感性［19］。既往研究表明miR-24-3p在MCF-7細胞中下調表達，促進乳腺癌細胞增殖和侵襲，進而影響乳腺癌預后［7］。本研究表明，過表達miR-24-3p可抑制乳腺癌細胞增殖，與前人研究相符，且過表達miR-24-3p增強了乳腺癌細胞的放射敏感性。

miRNA可通過調控其靶基因發揮多種生物學作用［20-21］。研究顯示，RNF2在乳腺癌組織中高表達，是一種癌基因［22］。沉默RNF2可能通過上調Bax以及下調cyclin D2、cyclin依賴性激酶4和Bcl-2誘導細胞周期停滯在G0/G1期并促進細胞凋亡，從而增強食管癌細胞的放射敏感性［23］；下調RNF2還可抑制膠質瘤細胞生長，增強U87細胞對放射的敏感性［24］。本研究表明，miR-24-3p靶向下調RNF2的表達，且白頭翁皂苷A促進miR-24-3p的表達，抑制RNF2的表達。這提示白頭翁皂苷A可能通過調控miR-24-3p/RNF2影響乳腺癌細胞的增殖及放射敏感性。

綜上所述，白頭翁皂苷A在體外具有抑制乳腺癌細胞增殖、增強其放射敏感性的作用。這些作用可能是通過上調miR-24-3p、下調RNF2的表達實現的。