M 1型巨噬細胞源外泌體增強卵泡膜細胞的活力*

高琳芝， 謝 云， 周 怡， 魏莉娜， 張 弛， 呂林艷，姚嘉慧， 梁曉燕， 劉貴華， 楊 星△

（1中山大學附屬第六醫院生殖醫學研究中心，廣東廣州510655；2中山大學附屬第一醫院男科，廣東廣州510080）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是最常見的育齡期女性排卵障礙疾病，嚴重影響女性生殖內分泌功能，是導致年輕女性月經紊亂、閉經和不孕最常見的原因［1-2］。PCOS最主要的病理生理特點為卵泡膜細胞過度增生及卵巢雄激素合成增加所致高雄激素血癥［3］。雖然目前針對降低PCOS患者雄激素水平藥物已廣泛應用于臨床，但這些藥物只能暫時性控制高雄激素血癥［2］。因此，了解PCOS的發病機制對于發現新的有效治療靶點至關重要。慢性亞急性炎癥狀態是導致PCOS患者高雄激素血癥的重要因素，而M1型巨噬細胞是參與形成PCOS患者體內慢性炎癥的關鍵細胞，其在PCOS體內堆積并分泌大量炎癥因子［4-6］。卵泡膜細胞是女性合成雄激素最重要的效應細胞，PCOS患者卵泡膜細胞較正常對照增殖明顯，是導致PCOS雄激素合成增加的關鍵原因。多項研究表明M1型巨噬細胞通過分泌炎癥因子促進雄激素合成并不能完全解釋PCOS患者M1型巨噬細胞堆積對卵巢雄激素合成的影響［7］。因此，PCOS患者慢性炎癥狀態如何影響卵巢雄激素合成功能仍有待闡明。

外泌體（exosomes，Exo）是一種可由多種細胞主動分泌、直徑為30～150 nm的磷脂雙分子層結構囊泡，近年來因其具有攜帶一系列生物分子如功能性蛋白質及mRNA等進行細胞或組織間遠距交流的靶向調控能力而備受關注［8］。已有研究報道外泌體在PCOS發病中起重要作用［9］。相關研究提示使用細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激活化的M1型巨噬細胞能模擬機體慢性炎癥狀態，并通過分泌外泌體發揮靶向調控作用，是多種疾病發生發展的關鍵因素［10］。然而，尚無研究M1型巨噬細胞來源外泌體在PCOS高雄激素血癥發生中作用和機制的報道。因此，我們假設M1型巨噬細胞分泌的外泌體可調節卵泡膜細胞的功能，研究來自M1型巨噬細胞分泌的外泌體對卵泡膜細胞活力的影響，并闡明其潛在的作用機制。

材料和方法

1 動物

SPF級昆明雌性小鼠，4周齡，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（粵）2016-0029。

2 主要試劑和儀器

DMEM培養基和DPBS緩沖液均購自Gibco；胎牛血清購自AUSGENEX；脂多糖、外泌體熒光標記PKH67試劑盒及外泌體分泌抑制劑GW4869購自Sigma；CCK-8試劑盒購自Dojindo；BCA蛋白濃度分析試劑盒和ECL顯影試劑盒購自Thermo；兔/鼠抗CD63、CD81、腫瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101 protein,TSG101）、鈣連蛋白（calnexin）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1B（cyclin-dependent kinase inhibitor 1B，CDKN1B）單克隆抗體購自Abcam；細胞周期試劑盒購自凱基生物；引物由上海生工公司合成。

流式細胞儀和Optima XE-100型超高速低溫離心機（Beckman Coulter）；H-7650型生物性透射電鏡（Hitachi）；納米流式檢測儀（廈門福流生物科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 巨噬細胞培養 小鼠巨噬細胞系Raw264.7由CytoBiotech惠贈。采用含10%胎牛血清及1%青、鏈霉素的高糖DMEM培養基培養于37℃、5%CO2恒溫培養箱。采用LPS誘導巨噬細胞構建M1型炎性巨噬細胞，濃度為100μg/L。

3.2 卵泡膜細胞的提取、培養和鑒定 小鼠卵泡膜細胞的培養參考文獻中的方法［11-12］。收集卵巢于DPBS中，體式顯微鏡下去除卵巢旁組織，無菌穿刺針穿刺卵巢釋放卵泡液及顆粒細胞。DPBS沖洗卵巢組織，無菌剪刀剪碎卵巢至約1 mm×1 mm×1 mm碎片，轉移至含I型膠原酶（5 g/L）的DMEM/F12培養基中，置于37℃水浴鍋中消化90 min，每10 min吹散組織碎片。消化結束后，使用40μm濾網過濾細胞懸液，去除未消化的組織碎片。DPBS清洗細胞懸液3次，使用1 mL DPBS重懸細胞，利用不連續密度梯度法純化卵泡膜細胞。吸取1 mL 50%Percoll梯度液于15 mL無菌離心管，1 mL 40%Percoll梯度液置于50%梯度液上層，細胞懸液置于40%梯度液上層，4℃下400×g離心20 min，純化后的卵泡膜細胞位于40%Percoll液層。使用DPBS清洗卵泡膜細胞懸液3次后，使用含10%胎牛血清及1%青、鏈霉素的DMEM/F12培養基重懸并接種于細胞培養瓶，37℃、5%CO2恒溫培養箱培養。

3.3 巨噬細胞與卵泡膜細胞共培養 LPS誘導的M1型巨噬細胞在Transwell小室中孵育過夜，卵泡膜細胞以每孔3×104細胞培養于24孔板中，細胞貼壁后，將上述Transwell小室轉移至24孔板中，構建巨噬細胞-卵泡膜細胞共培養體系。為了明確M1型巨噬細胞是否通過外泌體影響卵泡膜細胞的活力，使用10μmol/L GW4869預處理M1型巨噬細胞24 h，抑制其外泌體分泌。

3.4 Raw264.7巨噬細胞外泌體的提取 Raw264.7巨噬細胞生長至70%左右覆蓋時，DPBS清洗細胞2遍，換用無外泌體血清的完全培養基繼續培養，48 h后，收集細胞上清，細胞正常傳代。將收集到的細胞上清液于4℃連續離心（依次為300×g10 min，4 000×g10 min，12 000×g30 min）以除去死細胞及細胞碎片；上清液轉移至新的離心管中，4℃、100 000×g離心70 min；收集試管底部沉淀，使用0.22μm過濾后的DPBS重懸沉淀，0.22μm的濾網過濾；再次4℃、100 000×g離心70 min，得到的沉淀物即為外泌體。一部分沉淀物用過濾后的DPBS重懸，-80℃保存用于電鏡觀察、納米流式檢測及小鼠體內注射實驗；余下加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，提取外泌體總蛋白，-80℃保存用于后續Western blot實驗［13-14］。

3.5 Raw264.7巨噬細胞外泌體的鑒定 取上述實驗得到的外泌體樣品20μL，將樣品置于透射電子顯微鏡網格上室溫孵育2 min，再滴加3%磷鎢酸室溫靜置2 min，蒸餾水清洗網格，電子透射顯微鏡下觀察并拍照。取0.5 mL外泌體母液，1 mL超純水稀釋，用納米流式檢測儀對其粒徑進行檢測。取出外泌體蛋白樣品，SDS-PAGE進行分離，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉，加入抗CD63、calnexin、CD81和TSG101抗體及相應的II抗，凝膠成像系統拍照。

3.6 實驗分組 將穩定培養的卵泡膜細胞分為2個處理組，分別為正常巨噬細胞源外泌體（MC-Exo）處理組和M1型巨噬細胞源外泌體（M1-Exo）處理組。2組均在細胞貼壁后采用相同體積的培養基培養，外泌體（30 mg/L）提取過程嚴格遵守無菌操作，超速離心后得到的外泌體使用DMEM/F12完全培養基重懸。2組同時換相應的培養基培養24 h。

3.7 外泌體熒光標記示蹤 上述超速離心法獲得的外泌體，用DPBS溶解后，加入PKH67混懸液中，充分重懸混勻，室溫靜置5 min染色，加入等體積無外泌體血清終止染色，再次4℃、100 000×g離心70 min，沉淀為PKH67標記的外泌體，DPBS重懸后，再次超速離心，沉淀用培養基重懸后，并對卵泡膜細胞進行換液處理。將PKH67熒光標記的外泌體與24孔板內接種的卵泡膜細胞共孵育24 h，孵育結束后，使用PBS稀釋的1%多聚甲醛固定卵泡膜細胞15 min，4℃條件下DAPI染色30 min，熒光顯微鏡下檢測各組細胞熒光強度。

3.8 CCK-8法檢測細胞活力 卵泡膜細胞以每孔5×103密度接種于96孔，培養過夜至完全貼壁，每孔分別給予10μL外泌體PBS混懸液處理，繼續培養24 h后，每孔加入10μL CCK-8，于細胞培養箱中繼續孵育2 h，450 nm波長處檢測各組吸光度（A）。

3.9 流式細胞術檢測細胞周期分布 取對數生長期卵泡膜細胞，接種于6孔板中，對照組加入DMEM/F12完全培養基培養，加入含外泌體的DMEM/F12完全培養基，培養24 h后，按照細胞周期檢測試劑盒操作說明書，PBS清洗細胞，以70%無水乙醇固定細胞過夜。固定結束后，PBS清洗固定液，加入500μL染色工作液，室溫避光孵育30～60 min。上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

3.10 qPCR實驗 12孔板內卵泡膜細胞按各組處理24 h后，采用TRIzol法進行細胞總RNA提取，根據TaKaRa逆轉錄試劑盒根據相應操作對總RNA進行逆轉錄，獲取cDNA。使用SYBR Green qPCR Kit進行CDKN1B的qPCR檢測，以β-actin為內參照。PCR步驟為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s、60℃退火延伸30 s、72℃延伸30 s，共40個循環。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1. The sequences of theprimers for qPCR

3.11 Western blot實驗 6孔板內卵泡膜細胞按各組處理24 h后，采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。BCA定量后，采用20μg蛋白上樣于15%分離膠下進行電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入抗CDKN1B抗體稀釋液，孵育過夜后，使用相應的II抗孵育1 h，孵育結束后，化學發光顯影儀下顯影，采用ImageJ軟件進行灰度值統計分析。

4 統計學處理

用SPSS22.0軟件分析。計量資料表示為均數±標準差（mean±SD），兩組間均數比較采用Student'st檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠卵泡膜細胞培養及鑒定

小鼠卵泡膜細胞貼壁后呈紡錘形，折光性好。細胞免疫熒光染色結果顯示，提取的細胞表達3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD），陽性率大于95%，見圖1。這表明我們成功提取了卵泡膜細胞，并能進行后續研究。

Figure 1.Identification of the cultured theca cells by observing the immunofluorescence of 3β-HSD（×200）.圖1 卵泡膜細胞3β-HSD免疫熒光鑒定圖

2 M 1型巨噬細胞對卵泡膜細胞細胞活力的影響

為了明確M1型巨噬細胞是否影響卵泡膜細胞活力，我們在共培養系統中將LPS誘導后的M1型巨噬細胞與卵泡膜細胞共培養，同時使用外泌體分泌抑制劑GW4869預處理M1型巨噬細胞，抑制其外泌體的釋放。CCK-8實驗結果表明，共培養組卵泡膜細胞的活力增強，而在GW4869處理后，這一作用被消除，見圖2。

Figure 2.M1 macrophages enhanced the viability of theca cells.GW4869，a well-known inhibitor of exosome secretion，was used at a concentration of 10μmol/L to reduce the release of exosome from M1 macrophages.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs co-culture group；+P＜0.05 vs control group.圖2 M 1型巨噬細胞對卵泡膜細胞活力的影響

3 巨噬細胞來源外泌體的鑒定

我們利用超高速離心法提取巨噬細胞培養上清液中的外泌體，將所提取的外泌體置于透射電鏡下觀察，可見大小均一的杯狀結構，包膜完整，單個分布或聚集成群，粒徑大小在60 nm左右，見圖3A；納米流式檢測儀的結果顯示，所提取的外泌體平均粒徑為（69.4±19.4）nm，90%以上處于30～150 nm直徑范圍內，見圖3B；Western blot結果顯示，所提取的外泌體含有CD63、CD81和TSG101這3種外泌體標志蛋白，且不含calnexin，見圖3C。上述結果表明，M1型巨噬細胞分泌的外泌體被成功分離。

4 巨噬細胞分泌的外泌體能被卵泡膜細胞攝取

為了驗證巨噬細胞分泌的外泌體能否被卵泡膜細胞攝取，我們采用PKH67熒光標記的巨噬細胞源外泌體與卵泡膜細胞共孵育24 h，熒光顯微鏡下拍照，結果顯示共培養組卵泡膜細胞內出現明顯的PKH67綠色熒光，而對照組無熒光，見圖4。

5 M 1型巨噬細胞源外泌體對卵泡膜細胞活力的影響

將M1型巨噬細胞分泌的外泌體與卵泡膜細胞共孵育24 h，采用CCK-8法檢測細胞活力，結果顯示，M1型巨噬細胞源外泌體處理組卵泡膜細胞的活力較對照組顯著增強（P＜0.05），見圖5。

6 M 1型巨噬細胞源外泌體對卵泡膜細胞的細胞周期分布和CDKN1B表達的影響

流式細胞術結果顯示，與對照組相比，M1型巨噬細胞源外泌體處理組G0/G1期細胞比例明顯降低（P＜0.05），S期細胞比例顯著升高（P＜0.05），見圖6。既往研究表明，M1型巨噬細胞源外泌體可通過調控CDKN1B的表達影響靶細胞的增殖能力［15］。我們通過qPCR及Western blot實驗發現，M1型巨噬細胞源外泌體處理后的卵泡膜細胞CDKN1B的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），見圖7。

Figure 3.The extraction and identification of exosomes（Exo）secreted by Raw264.7 macrophages（MC）.A：electron microscopic analysis（the scale bar=50 nm）；B：the size distribution of the exosomes detected by flow nanoanalyzer；C：the expression of exosome-specific markers CD63，CD81 and TSG101 measured by Western blot.圖3 Raw264.7巨噬細胞來源外泌體的提取與鑒定

Figure 4.Fluorescence microscopic observation of theca cells after incubation with PKH67-labeled macrophage-derived exosomes（×200）.圖4 卵泡膜細胞內示蹤PKH67標記的巨噬細胞源外泌體

討 論

Figure 5.The effects of exosomes secreted by M1 macrophages on the viability of theca cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖5 M 1型巨噬細胞源外泌體對卵泡膜細胞活力的影響

卵泡膜細胞對卵泡的發育及卵子成熟至關重要，且可調節卵巢甾體激素的合成，是卵巢雄激素合成的主要來源；卵泡膜細胞功能失調是PCOS患者高雄激素血癥的關鍵原因［2，16］。3β-HSD是卵泡膜細胞特異性表達的分子，我們采用梯度離心法分離純化得到的小鼠卵泡膜細胞95%以上表達3β-HSD蛋白，證實成功獲取小鼠卵泡膜細胞。慢性亞急性炎癥長期以來被認為在PCOS的發病機制中發揮著重要作用，是卵巢卵泡膜細胞功能障礙繼而雄激素合成增加的主要原因；PCOS患者體內慢性亞急性炎癥表現為局部組織M1型巨噬細胞堆積，伴隨炎癥因子分泌增加［12-13］。然而，M1型巨噬細胞導致卵泡膜細胞功能障礙的機制尚未被闡明。有研究表明使用LPS刺激巨噬細胞，可誘導產生形成體內慢性炎性狀態的M1型巨噬細胞，模擬PCOS患者體內的慢性炎癥狀態［14］。本研究根據此方法使用LPS刺激Raw264.7巨噬細胞構建M1型慢性炎性巨噬細胞模型，用以模擬PCOS患者體內的慢性炎癥狀態［17］。外泌體作為廣泛認可的包裹多種生物學分子的細胞外囊泡，具有調控靶細胞的功能［18］。最近研究表明，巨噬細胞分泌的外泌體是其發揮靶向調控作用的關鍵途徑［19］。我們構建了M1巨噬細胞-卵泡膜細胞共培養體系，并使用GW4869抑制巨噬細胞外泌體分泌，CCK-8實驗結果表明M1巨噬細胞通過外泌體增強卵泡膜細胞活性。進一步使用超速離心法富集巨噬細胞分泌的外泌體，通過Western blot、電鏡及納米粒徑分析儀進行鑒定，我們發現巨噬細胞源外泌體具有典型的杯狀結構，直徑在50～100 nm之間，且表達外泌體標志蛋白CD63、CD81和TSG101等，提示成功提取巨噬細胞外泌體。

Figure 6.The effect of the exosomes derived from M1 macrophages on the cell cycle of theca cells was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖6 M1型巨噬細胞分泌的外泌體對卵泡膜細胞細胞周期分布的影響

Figure 7.The effects of the exosomes derived from M1 macrophages on the mRNA（A）and protein（B）expression levels of CDKN1B were detected by qPCR and Western blot，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs MC-Exo group.圖7 M 1型巨噬細胞分泌的外泌體對卵泡膜細胞CDKN1B表達水平的影響

既往研究認為M1型巨噬細胞可能通過分泌炎癥因子，改變卵巢局部微環境進而導致卵泡膜細胞功能障礙［4］。但是針對體內炎癥因子的治療并不能有效控制高雄激素血癥，結合我們共培養實驗結果，提示M1型巨噬細胞可能通過外泌體途徑調控卵泡膜細胞功能。我們通過外泌體示蹤實驗發現，使用PKH67標記的巨噬細胞源外泌體與卵泡膜細胞共培養后，卵泡膜細胞內出現PKH67綠色熒光，提示巨噬細胞源外泌體可被卵泡膜細胞攝取。

卵泡膜細胞增生是 PCOS 重要的病理特征［2，20］。我們通過CCK-8實驗發現M1型巨噬細胞源外泌體促進卵泡膜細胞的活力，提示PCOS患者體內異?；罨腗1型巨噬細胞可能通過分泌外泌體促進卵泡膜細胞生長，參與PCOS發病過程。我們進一步借助流式細胞術發現，與M1型巨噬細胞源外泌體共孵育后，卵泡膜細胞較對照組G0/G1期縮短，S期細胞相對增多，提示M1型巨噬細胞通過分泌外泌體促進卵泡膜細胞由G1期進入S期。CDKN1B是細胞周期素依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKI）家族的成員，與細胞周期關系密切，可以阻斷細胞從G1期到S期［21］。本研究通過qPCR及Western blot實驗檢測組間CDKN1B表達水平的差異，發現M1型巨噬細胞源外泌體抑制卵泡膜細胞CDKN1B的mRNA及蛋白表達。這提示M1型巨噬細胞源外泌體通過負向調控卵泡膜細胞CDKN1B的表達，進而促進卵泡膜細胞由G1期進入S期。多項研究發現M1型巨噬細胞源外泌體通過轉運miRNA、mRNA等，調控細胞周期相關蛋白的表達，進而影響靶細胞增殖及功能，可能是外泌體增強卵泡膜細胞活力的潛在機制［15］。

綜上所述，本研究證實了M1型巨噬細胞可以通過分泌外泌體引起卵泡膜細胞活力的改變，其潛在的機制可能是通過下調CDKN1B的表達進而促進卵泡膜細胞由G1期進入S期。這為進一步探討PCOS疾病狀態下慢性炎癥狀態導致高雄激素血癥的作用機制提供新的思路，外泌體可能成為改善PCOS高雄激素血癥的潛在重要靶點。