污泥中蛋白類物質厭氧轉化影響因素及其促進策略研究進展

陳思思，楊殿海，龐維海，董濱，戴曉虎

（同濟大學環境科學與工程學院，上海200092）

蛋白類物質（在污泥中難以分離純凈的蛋白質，一般用有機氮的含量乘以6.25的值來代表蛋白類物質的含量[1]）是剩余污泥中的主要有機組分（占有機質的50%～60%）[2]，是污泥厭氧消化產沼氣的主要底物，其降解率的提升將對剩余污泥厭氧轉化效率的提升起到決定性所用。與此同時，蛋白類物質是污泥中氮元素的最主要載體，對蛋白類物質降解轉化的研究將促進污泥厭氧消化過程中氮循環的理論研究。此外，蛋白類物質更是剩余污泥中的主要親水性物質，其在決定污泥脫水性能方面發揮著比多糖和腐殖質類物質更明顯的作用[3-4]。最新研究表明污泥的表面親水指數與污泥胞外蛋白質二級結構中的α螺旋的比例有著較強的正相關性，且污泥的親水性能相比于胞外蛋白質親水官能團的含量，更多地取決于親水官能團的空間分布[4]。因此，明晰剩余污泥中蛋白類物質的厭氧轉化機制和限制性因素，將有利于明晰我國污泥厭氧轉化的限制機制，從而對其進行針對性強化，這不僅可以從源頭上強化我國剩余污泥的厭氧轉化效率，完善污泥厭氧消化過程中的氮循環理論，還可能從減少親水性物質的角度改善其后續的脫水性能。

本文重點歸納了污泥中蛋白質的厭氧轉化機制，并在此基礎上總結了污泥中蛋白類物質厭氧轉化的影響因素和對其定向促進的研究進展，以期為污泥中蛋白類物質的定向厭氧轉化提供借鑒與啟發。此外，系統性總結了污泥中蛋白類物質的前沿解析方法，旨在為污泥中蛋白類物質的研究提供全面支撐。

1 蛋白質厭氧轉化機制

在厭氧消化過程中，蛋白質完全轉化為甲烷與二氧化碳的過程可概括為4個過程：①胞外酶分解作用（蛋白質水解階段）；②大分子有機物發酵為有機酸（氨基酸發酵階段）；③發酵中間產物降解為乙酸（產酸階段）；④以乙酸或氫氣/二氧化碳產甲烷（產甲烷階段）。

1.1 蛋白質水解

蛋白質是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經過盤曲折疊形成的具有一定空間結構的物質，可由胞外酶（蛋白酶）水解成其組成的多肽和氨基酸。研究表明，蛋白質在厭氧反應器中的降解機制與在動物體內如瘤胃中的降解機制存在較大差異。在瘤胃中，需由糖類發酵細菌降解蛋白質，而氨基酸的發酵并不能為其提供足夠的能量[1-5]；在厭氧反應器中，由具有蛋白水解作用的細菌主導蛋白質的降解，這些過程能夠為其代謝過程提供足夠的能量[6]。同時也有大量研究表明消化污泥中主要的蛋白水解細菌為革蘭氏陽性菌，主要為梭狀芽胞桿菌屬（genusClostridia），同時這些細菌也在氨基酸發酵中發揮著重要作用[6]。

根據水解程度，蛋白質水解可以分為完全水解（得到的水解產物為各種氨基酸的混合物）和部分水解（水解產物是各種大小不等的肽段和單個氨基酸），在這個過程中必須要對其二級結構和一級結構造成一定程度的改變。蛋白質二級結構指它的多肽鏈中有規則重復的構象，限于主鏈原子的局部空間排列，不包括與肽鏈其他區段的相互關系及側鏈構象，二級結構主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲，是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的，氫鍵是穩定二級結構的主要作用力[7]。蛋白質二級結構將直接影響蛋白質的穩定性和絮凝特性，研究表明α-螺旋將誘導蛋白質的穩定性，促進活性污泥的聚集性和絮凝性；而反平行的β-折疊和無規卷曲結構的大量存在將會減弱活性污泥的穩定性與聚集性[8-10]，蛋白質的穩定性與聚集性越強，酶或微生物等與其接觸對其利用就越困難。蛋白質的一級結構是指蛋白質多肽鏈中氨基酸的排列順序，以及在蛋白質分子中起到穩定肽鍵空間結構作用的二硫鍵的位置，這是由遺傳信息決定的。對蛋白質一級結構的破壞、釋放肽鏈中的氨基酸降有利于酶或微生物等對其利用進而進行氨基酸發酵過程[11]。

1.2 氨基酸發酵

各類氨基酸在分子量大小和結構上存在著很大差異，對其降解也根據類型和濃度的不同存在著多種代謝途徑和相應的代謝產物。這些代謝產物包含各種不同的有機物（主要為短鏈和支鏈有機酸）、氨氮、二氧化碳以及少量氫氣和含硫化合物。氨基酸發酵已經得到大量文獻報道[12-17]，通過分離微生物種群，在生化和生理方面對氨基酸發酵進行了大量的深入研究。

氨基酸降解主要通過兩種途徑：①成對的氨基酸可通過Stickland反應得到降解；②單一氨基酸也能通過另外一種過程得到降解（非耦合降解），該過程需要氫利用型細菌的存在。其中Stickland反應是氨基酸分解的常見過程，通常需要一個氨基酸作為電子供體（其產物由于少一個碳原子而短于原氨基酸），同時需要另一個氨基酸作為電子受體（其產物中碳原子數量與原氨基酸相同）。一些特定的氨基酸既能作為電子供體，也能作電子供體（如亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和精氨酸）。Stickland反應是氨基酸發酵最簡單的方式，且每轉化1mol 的氨基酸將會為細胞提供約0.5mol 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）[12]。與非耦合氨基酸分解相比，通過Stickland反應的分解過程更加迅速[13]。

各類氨基酸厭氧發酵細菌如表1 所示。依據Mead[17]和McInerney[6]的研究，這些細菌依據他們參與的Stickland反應以及利用氨基酸的種類主要被分為5類。表1中也依據Hippe[14]的研究總結了每種細菌所產生的酶以及這些細菌的特點。第一類細菌為主導Stickland反應的微生物，在發酵過程中，他們都能夠利用脯氨酸產生中間產物包括δaminovalerate、α-aminobutyrate 或γ-aminobutyrate。參與Stickland反應的常見氨基酸包括脯氨酸、絲氨酸、精氨酸、精氨酸、甘草、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、三氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

氨基酸發酵細菌中不能進行Stickland反應的微生物如表1中二、三、四、五類所示，其中主要包括嚴格的產孢菌類（梭狀芽胞桿菌種Clostridialspecies） 以及不產孢子的專性厭氧微生物如Peptostreptococcus（Micrococcus）等。其他也能夠降解氨基酸的微生物如Campylobacterspp. 、Acidaminococcusfermentans、Acidaminobacter hydrogenoformans、Megasphaera elsdenii、Eubacterium acidaminophilum以及一些硫酸鹽還原菌[18]。第二類細菌都能利用甘氨酸，有些種也能夠利用精氨酸、組氨酸、賴氨酸。第三類細菌都能利用組氨酸、絲氨酸和谷氨酸，有些種類也能夠利用精氨酸、天冬氨酸鹽、蘇氨酸、酪氨酸和色氨酸。第四類細菌只包含利用絲氨酸和蘇氨酸的C.putrefaciens。第五類細菌只包含能利用丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和半胱氨酸的C. propionicum。以上四類細菌都不能產生在Stickland 反應中所發現的δ-aminovalerate。在混合環境、存在混合氨基酸的條件下，非耦合的氨基酸降解只能在作電子受體的氨基酸缺乏時才能夠發生，對于酪蛋白、白蛋白和明膠等蛋白質，經非耦合過程降解的氨基酸只占全部氨基酸降解量10%以下[19]。

表1 降解氨基酸的厭氧細菌匯總

2 污泥中蛋白類物質厭氧轉化的影響因素

Tian 等[20-21]根據X 射線光電子能譜分析圖譜分析將污泥中含氮物質分為蛋白質、無機氮、吡咯和吡啶等四類。在復雜的污泥厭氧消化系統中，蛋白類物質的降解率已有部分文獻報道。一些研究主要報道了厭氧消化后污泥中蛋白類物質與多糖的降解率，Pinnekamp[22]發現污泥經厭氧消化后，蛋白類物質和多糖的降解率分別為39% 和52%；在Bougrier 等[23]的研究中蛋白類物質和多糖的降解率分別為35%和50%；Chen 等[2]發現脫水污泥經SRT為20 天的中溫厭氧消化后，蛋白類物質和多糖的降解率分別為46.2%和49.4%?？梢娢勰嘀械牡鞍踪|的厭氧消化降解率普遍較低，由于蛋白類物質為污泥中最主要的有機成分，因此其較低的降解率將主要限制污泥的厭氧消化效率。

在系統運行過程中，蛋白質的降解主要受到基質中其他有機物尤其是多糖的影響、代謝產物氨氮的影響以及其來源的影響，相關研究歸納見表2。Breure 等[24]研究了高濃度糖類（最高可達5g/L）對明膠的水解和酸性發酵的影響（最高可達5g/L），在明膠培養基達到穩定狀態后添加相對高濃度的葡萄糖或乳糖作為二次基質，發現在基質中碳水化合物的濃度升高時蛋白質的降解會逐漸減慢，明膠的降解率在其單獨發酵和有碳水化合存在的條件下分別為90%和77%；Tommaso 等[25]研究了碳水化合物對牛血清蛋白厭氧消化效率的影響，結果發現盡管添加碳水化合物后系統運行更加穩定，但其中蛋白質的降解率下降了8.8%。Yang 等[26]研究了其中蛋白類物質與多糖的厭氧消化動力學，發現在污泥中多糖比蛋白類物質先降解，且其效率高于蛋白質，厭氧消化前3天由于多糖的快速降解抑制了蛋白酶的形成，使得蛋白質的降解處于停滯期，停滯期后蛋白質的降解與多糖一樣都遵循一級動力學，且分為快速降解和慢速降解兩個階段。鑒于多糖對蛋白質降解的抑制作用，在基質中蛋白質和多糖同時存在的情況下，有研究從碳氮比的角度對蛋白質與多糖在基質中的最佳配比做了研究，發現蛋白質與多糖的比例為8∶2時能夠達到最佳的共消化效果[27]。氨氮是蛋白質代謝的重要終產物，其含量過高時會對系統內的細菌與古菌都產生毒害作用，從而降低系統的水解酸化以及產甲烷效率[28-29]，在Li 等[28]的研究中也證明了在氨氮濃度升高的情況下，與氨基酸代謝相關的功能基因受到了抑制；在Chen 等[30]的研究中對氨抑制的緩解做出了研究，發現系統經馴化恢復之后其蛋白質的降解會得到恢復。研究還發現，在Wagner 等[31]的研究中，酵母提取物和絡蛋白氨基酸的降解產氣率遠高于牛奶中蛋白，特定的蛋白來源中，精氨酸有著最高的降解產氣率，且其降解基本不受碳氮比的影響。由此可見由系統運行、物料配比以及代謝產物等因素帶來的對蛋白類物質厭氧轉化的限制作用，通過系統的優化和調控，都已被報道可得到解決或緩解。

此外，污泥中蛋白質的降解還會受到污泥中無機物如微細砂（二氧化硅）[32]和金屬離子的影響[33]。Dai 等[32]研究表明微細砂會與蛋白質形成蛋白-微細砂結合體，導致有機質的酶結合位點減少、表面位點密度下降、表觀活化能的上升，導致污泥中蛋白質降解率降低；蛋白質中的羧基是金屬離子與有機物絡合的重要橋連基，金屬離子與蛋白質的絡合將限制其的水解及其后續降解[34-35]。

3 污泥中蛋白類物質厭氧轉化的促進研究

在完善厭氧消化系統運行、調控其內部因素的基礎上，大量學者開發了一系列預處理措施如酸堿預處理[36]、超聲預處理[37]、生物預處理[38]、熱水解預處理[39]等改善有機組分的溶出性能以提高其中蛋白質的降解率，強化污泥厭氧消化效率，相關研究總結見表2。

表2 污泥中蛋白類物質厭氧轉化的影響因素及促進研究總結

研究表明破壞蛋白質折疊構型是水解的必要步驟，打破蛋白質的氫鍵網絡與折疊構型也將有助于蛋白質水解及利用效率的提高[43]。Devlin 等[36]發現經酸預處理后蛋白質與多糖的降解率分別提高了7%和9%；Appels 等[44]研究發現低溫熱水解（60～90℃）未能明顯促進這兩類有機物的降解；Feng等[40]研究發現添加零價鐵后污泥中蛋白類物質與多糖的降解率分別提高了15%和34.1%；Shao 等[41]發現好氧消化相比于厭氧消化更能夠實現蛋白類物質的有效降解；Xiao等[42]對比研究了酸、堿、紫外照射預處理改變蛋白質構象對提高蛋白質廢水發酵產氫氣的效果，結果表明使用紫外線照射能有效達到破壞蛋白質氫鍵及其構型的效果，對其水解起到了促進作用；Chen 等[2]發現經高溫熱水解（160℃）后脫水污泥中蛋白類物質的降解率提高了28.9%。

可見針對蛋白類物質的賦存狀態與結構強化其厭氧轉化的策略目前處于多種方法進行嘗試的階段，在以上強化措施中，效果尚可且較容易工程推廣的技術為高溫熱水解技術，這一技術已被研究表明能夠增強蛋白質的溶解，且其對污泥厭氧消化性能的強化作用得到了大量的工程驗證[45]。然而由于污泥泥質的較大差異和強化機制研究的缺乏，其促進效率仍參差不齊[39,46-47]，高溫熱水解在突破我國剩余污泥厭氧消化瓶頸上是否具有關鍵性作用也亟待研究。

4 污泥中蛋白類物質的解析方法

4.1 氨基酸的測定方法

在眾多的氨基酸測定方法中，沼液中總氨基酸量的測定主要通過茚三酮比色法[48]，而沼液中的氨基酸組分的測定，主要以氣相色譜法[49]和高效液相色譜法[50]為主。由于大多數氨基酸無紫外吸收和熒光發射特征，為提高分析檢測靈敏度和分離選擇特性，通常需將氨基酸進行柱前或柱后衍生化，并選用陽離子交換或反相液相色譜法對其進行分離并經紫外或熒光檢測（OPA/FMOC-Cl/RT-HPLC）來實現各組分的測定[51]，能使氨基酸產生熒光的衍生劑有鄰苯二甲醛（OPA）、9-氯甲酸芴甲酯（FMOCCl）、丹酰氯（DANSYL-Cl）等。沼液中溶解游離氨基酸的含量較低，并且沼液中復雜的其他成分以及所包含的許多細小固體懸浮物會對衍生化過程產生干擾，如高濃度氨氮和揮發性胺容易與某些待測氨基酸形成熒光副產物，干擾氨基酸的分析與測定。孟慶國等[49]采用氣相色譜法測定了沼液中的18 種溶解游離氨基酸，然而，該研究中所采用的分析方法較為繁瑣，且未涉及樣本加標回收率、精密度等參數的進一步分析。氨基酸是一類包含至少一個羧基和一個氨基官能團的化合物（等電點2.8～10.8），它在不同的pH條件下，會以陽離子、陰離子和中性分子的形式存在。因此，李建華等[52]研究開發了pH調節（pH=10.2）旋蒸濃縮聯合超濾離心（3K Millipore）的前處理新方法，并在此基礎上進一步采用OPA-FMOC-Cl 作為柱前衍生化試劑，使用反相高效液相色譜對沼液中的溶解游離氨基酸進行分析，并通過外標法對所開發的沼液中溶解性氨基酸分析方法進行了評估。結果表明，與傳統的SCX-SPE 小柱固相萃取方法相比，所使用的新預處理方法因其較高的回收率和精確度及操作的簡便性而更適用于沼液中溶解游離氨基酸的測定，并且避免了SCX-SPE 法對氨基酸選擇性吸附和對其他干擾物的非選擇性吸附而導致的部分氨基酸損失過大的現象。

4.2 熒光光譜法

污泥液相中有機物初始狀態及被微生物降解代謝過程中的絡氨酸、蛋白質、類富里酸和類胡敏酸等在紫外光的激發下會產生特征熒光，顯示出其組成和官能團結構的大量信息[53]。三維熒光光譜法（excitation-emission-matrices，EEM）因具有快速性、選擇性與敏感性，被廣泛應用于對蛋白質和腐殖酸等物質的檢測中[54]，然而原始譜中重疊的熒光團和熒光帶經常影響對物質性質的解析與測定。平行因子分析法（parallel factor analysis，PARAFAC）可以將熒光信號分解為相對獨立的熒光現象而加以鑒別，從而提高了準確性，將平行因子分析引入三維熒光光譜分析是對該技術的重要提升[55]。運用PARAFAC 分析后，溶解性有機物中的組分一般被分為兩大類：類腐殖質物質和類蛋白質物質。依據各類有機物的最大激發和發射波長，溶解性有機物中能被鑒別出的物質有類絡氨酸、類色氨酸、類蛋白質、不同種類的類腐殖質如富里酸等[56]。Li 等[57]采用EEM-PARAFAC 表征了脫水污泥中有機物在厭氧消化過程中的遷移轉化，發現其上清液中的熒光類物質包括類絡氨酸、類色氨酸以及類腐殖質類物質含量逐漸上升，且蛋白質的含量發生了明顯的快速降低。

4.3 宏蛋白組學

由于污泥中的主要蛋白類物質成分來源于微生物細胞內或其分泌的胞外聚合物，且污泥的厭氧消化過程是由微生物主導，而蛋白質是微生物生命活動的主要承擔者，因此從蛋白質信息出發分析微生物功能與代謝途徑將是解析污泥中蛋白質降解途徑的必要條件。宏蛋白組學（metaproteome，或稱元蛋白質組學）從宏基因組學（將群落中所有微生物DNA 提取出來研究）的概念中提出，指環境混合微生物群落中所有生物的蛋白質組總和[58]。其功能與優點在環境生物學分析中主要體現在以下3個方面：①可較準確地反映活性污泥微生物脫氮除磷、去除有機物代謝活動，還可用于跟蹤新的功能基因、代謝途徑中或者在環境脅迫下微生物產生的特征性蛋白質[59]；②可以整體把握活性污泥微生物的功能及其動態，是理解宏代謝組學（生態系統中所有微生物的代謝產物）的關鍵步驟[60]；③宏蛋白質組學可以為研究活性污泥功能性微生物設計特異性探針，在線鑒定和定量分析特定群落微生物表達的蛋白質，推動活性污泥微生物種群多樣性的研究發展[61]。Abram 等[62]首次將宏蛋白質組學用于厭氧消化（AD）系統中的顆粒污泥微生物研究，結果表明在低溫（15℃）環境下，以葡萄糖為基質的合成廢水厭氧消化過程中，檢出的18 個蛋白質中有14個與糖酵解和產甲烷作用代謝功能密切相關，為低溫下AD系統處理廢水過程中生物降解轉化途徑的研究提供了理論依據。Hagen 等[63]采用宏蛋白組學解析了高溫厭氧消化系統中的細菌與古菌分別的產酸與產甲烷代謝途徑、參與中間產物代謝的主要蛋白質以及脂肪酸的代謝網絡。因此，采用宏蛋白組學對于厭氧消化過程中有機物的代謝途徑，尤其是對蛋白質及其重要的代謝功能的表征具有一定的可行性。

5 結語與展望

蛋白質的厭氧降解主要包括蛋白質水解與氨基酸代謝兩個重要步驟，蛋白質的結構與氨基酸組分差異將決定其厭氧轉化性能和持水能力。污泥胞外蛋白質二級結構中α-螺旋的比例與污泥的表面親水指數呈現顯著正相關關系。蛋白質來源、污泥中其他有機物如多糖、污泥中無機物如微細砂（二氧化硅）和金屬離子、以及代謝產物如氨氮等都會對污泥中蛋白類物質的厭氧轉化性能帶來顯著的影響。這些影響通過一定的預處理手段可以得到緩解，研究發現破壞蛋白質的構象、二級結構與氫鍵網絡等將有效強化其厭氧轉化性能，且在眾多策略中，高溫熱水解技術發揮了有效的作用并得到了廣泛應用。然而對污泥中蛋白類物質的研究仍然停留在定性階段，鮮有準確的定量轉化研究。通過對污泥中蛋白類物質的前沿解析方法包括氨基酸測定方法、熒光光譜法和宏蛋白組學的歸納與總結，可以在一定程度上推動污泥中蛋白類物質的研究，促進其定向轉化研究，從而強化其厭氧轉化性能以及消化產物的脫水性能。