非達霉素的HPLC快速檢測方法

林 旸，王 月，王海燕，高月麒，任風芝，李曉露，張雪霞

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015)

非達霉素(Fidaxomicin)是一種十八元環結構的新型大環內酯類抗生素，屬于窄譜型抗菌藥物[1-2]。其抗菌作用機理新穎，通過抑制RNA聚合酶對抗艱難梭菌，能針對性地殺滅艱難梭菌，使腸道菌群恢復正常，從而降低艱難梭菌感染復發率[3]。與治療艱難梭菌感染的傳統藥物萬古霉素相比，非達霉素具有更強的療效和更低的復發率，而且該藥物交叉耐藥性低，不良反應少，目前臨床試驗中尚無非達霉素耐藥性的報道[4-6]。

非達霉素通過桔橙指孢囊菌發酵而得，屬于B類臺勾霉素，主要通過微生物發酵生產[7]。在菌種選育、發酵提取過程中，往往有大量樣品需要檢測，而中國藥典(2015年版)和美國藥典(USP 40)尚未將非達霉素收載。因此，建立快速、準確、精密的分析方法對于非達霉素菌種選育和工藝研究尤為重要。近年來，國內也有少量關于非達霉素定性分析方面的研究報道[8-9]，如江宏磊等[9]以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相進行等度洗脫，非達霉素出峰時間在16～17 min，整個色譜采集周期為30 min，分析時間較長，不能滿足大批量樣品的處理，而且其線性范圍取值較窄，無法準確測定后續樣品的含量?；诖耍髡卟捎肏PLC法測定非達霉素含量，擬為非達霉素菌種選育、發酵、提取過程樣品的含量及相關物質分析提供一種簡便、快速、高效的方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

非達霉素發酵液，華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司；非達霉素標準品(含量99.2%)、去離子水，自制；乙腈(色譜純)，美國Merck公司；其它試劑均為國產分析純。

高效液相色譜儀(SPD-M20A 型紫外檢測器，LC-20AT型泵，SIL-20A型自動進樣器，CTO-10AS型柱溫箱)，日本Shimadzu公司；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標準溶液

精密稱取非達霉素標準品25 mg，置于50 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容，搖勻，制成0.5 mg·mL-1的非達霉素標準溶液，冰箱內保存，備用。

1.2.2 發酵液供試溶液

發酵液真空抽濾后，得到非達霉素菌絲體。將乙醇加入菌絲體中至發酵液體積，振蕩浸泡1 h，離心，浸提液經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得發酵液供試溶液。非達霉素為胞內產物，菌絲體中所占比例大于95%，故所測浸提液單位可以視為發酵液中的非達霉素含量。

1.3 色譜條件

Unitary C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.05%乙酸水溶液(55∶45，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長230 nm，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，進樣時間10 min。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的確定

稱取非達霉素標準品適量，加入甲醇溶解，制成含非達霉素20 μg·mL-1的供試溶液，用紫外分光光度計在200～800 nm范圍內掃描，結果如圖1所示。

圖1 非達霉素的紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Fidaxomicin

由圖1可知，非達霉素在230 nm、266 nm處均有較大吸收峰，其中266 nm處的吸收較弱。因此，選擇230 nm作為檢測波長。

2.2 檢出限和定量限

將非達霉素標準溶液進行逐步稀釋后，進樣10 μL進行測定。檢出限色譜峰信噪比S/N≈3，定量限色譜峰S/N≈10。測得非達霉素的檢出限為20 ng(相當于進樣量的0.4%)，定量限為60 ng(相當于進樣量的1.2%)。

2.3 系統適用性

分別精密量取10 μL非達霉素標準溶液、發酵液供試溶液，進樣測定，結果見圖2。

由圖2可知，在該色譜條件下，發酵液供試溶液與非達霉素標準溶液出峰時間一致，峰型良好，表明非達霉素與有關物質可以達到基線分離。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線和線性關系

精密稱取非達霉素標準品100 mg，置于50 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，然后逐級稀釋為濃度0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1的非達霉素標準溶液，按1.3色譜條件分別進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(y)、進樣濃度(x,mg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=22973.2456x+480175.4222，相關系數R2=0.9991，截距1.0%。表明，非達霉素濃度在0.05～2.0 mg·mL-1范圍內與峰面積線性關系良好。

圖2 非達霉素標準溶液(a)、發酵液供試溶液(b)的高效液相色譜Fig.2 HPLC spectra of Fidaxomicin standard solution(a) and fermentation broth test solution(b)

2.4.2 重復性

精密吸取同一批次發酵液，按1.2.2方法平行制備6份發酵液供試溶液，按1.3色譜條件進行測定，測得非達霉素峰面積RSD為0.4%。表明該方法重復性好。

2.4.3 精密度

精密吸取同一批次發酵液，按1.2.2方法平行制備6份發酵液供試溶液，由不同分析人員使用不同儀器，連續進樣6次，按1.3色譜條件進行測定，測得非達霉素峰面積RSD為0.75%。表明該方法精密度良好。

2.4.4 耐用性

通過微調整柱溫、流速、流動相中乙酸含量、波長(表1)，考察非達霉素測定結果不受影響的程度。要求不同色譜條件參數下，RSD≤2.0%。

表1色譜條件的變動范圍

Tab.1 Range of variation of chromatographic conditions

參數色譜條件變動范圍柱溫/℃3530,40流速/(mL·min-1)1.00.95,1.05流動相中乙酸含量/%0.050.045,0.055波長/nm230228,232

結果發現，改變以上色譜參數時，所測樣品濃度幾乎不變，柱溫、流速、流動相中乙酸含量、波長變化時，RSD分別為0.83%、1.6%、1.6%、1.2%，均符合要求。表明該方法在對色譜參數做微小變動時，非達霉素測定結果所受影響較小。

2.4.5 穩定性

取發酵液供試溶液于室溫下保存，每隔2 h取10 μL進行測定，考察供試溶液在24 h內的穩定性。測得非達霉素峰面積RSD為0.27%，表明供試溶液室溫下放置24 h穩定。

2.4.6 加標回收率

分別精密稱取非達霉素標準品25 mg、50 mg、75 mg各3份，分別置于50 mL容量瓶中，用已知含量的浸提液溶解，各進樣10 μL，測定峰面積，結果見表2。

表2非達霉素的加標回收率

Tab.2 Adding standard recovery of Fidaxomicin

由表2可知，樣品平均加標回收率為93.5%，RSD為0.8%。

2.5 非達霉素含量的測定

取3批發酵液供試溶液于樣品瓶中，按1.3色譜條件進行測定，發酵液中非達霉素的出峰時間與標準品吻合，與其它有關物質能有效分離。按外標法以峰面積計算非達霉素含量，結果見表3。

表3發酵液中非達霉素含量/(mg·mL-1)

Tab.3 Content of Fidaxomicin in fermentation broth/(mg·mL-1)

3 結論

建立了快速檢測非達霉素含量的HPLC方法，并對其進行了方法學驗證。結果表明，非達霉素濃度在 0.05～2.0 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數R2=0.9991；樣品平均加標回收率為93.5%，RSD為0.8%。該方法精密性、重復性、穩定性、耐用性良好，且操作簡單，快速有效，回收率良好，適用于含非達霉素樣品的檢測，解決了微生物發酵法產生大量樣品而檢測速度慢的問題，為進一步優化非達霉素生產工藝奠定了基礎。