干巴菌多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究

趙紅艷，張鴨關(guān)，史俊友

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011)

干巴菌(ThelephoraganbajunZang)主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，在云南省主要分布在昆明、呈貢、嵩明、安寧、曲靖、馬龍等地，其分布集中在海拔1 000～1 200 m的松林中[1-2]。該菌隸屬于擔(dān)子菌門、革菌目、革菌科、革菌屬[3]。干巴菌外貌不突出，但營(yíng)養(yǎng)豐富，含有粗蛋白、粗脂肪、總糖、灰分等營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)還含有16種氨基酸、多種微量元素、維生素及其特有的具有高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的革菌酸[4-6]。干巴菌還有一定的藥用價(jià)值，因其含有的多糖體是醫(yī)藥方面最強(qiáng)的調(diào)節(jié)劑和免疫劑，同時(shí)又因該多糖成分能夠提高相應(yīng)淋巴細(xì)胞活性，從而能夠在癌癥的增殖及轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮抑癌作用[7]。干巴菌還含有極豐富的抗氧化物質(zhì)，能夠清除人體內(nèi)的各種加速細(xì)胞凋亡甚至讓細(xì)胞壞死的氧化自由基，進(jìn)而達(dá)到延緩衰老的作用[8]。作者以干巴菌多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化干巴菌多糖的提取工藝，通過測(cè)定干巴菌多糖對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及羥基自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為干巴菌的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

野生干巴菌，采自云南省曲靖市，清洗干凈后,于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，備用。

苯酚、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀、葡萄糖、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、水楊酸、濃硫酸、三氯化鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液等均為分析純。

JK-G-350A3型植物粉碎機(jī)，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KM-1000型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器廠；AL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 干巴菌多糖的提取

精確稱取干巴菌粉末2.0 g于燒杯中，按照一定料液比加入蒸餾水，于一定溫度下在恒溫水浴中提取一定時(shí)間，過濾；將濾液濃縮至20 mL，加入乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%，靜置過夜；5 000 r·min-1離心10 min，過濾，干燥，得干巴菌多糖。采用苯酚硫酸法測(cè)定干巴菌多糖含量。

1.3 干巴菌多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，g∶mL，下同)、提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、提取時(shí)間(1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h)對(duì)干巴菌多糖提取率的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間及料液比為考察因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.4 干巴菌多糖的抗氧化活性評(píng)價(jià)

參照文獻(xiàn)[9]方法測(cè)定干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除率，參照文獻(xiàn)[10]方法測(cè)定干巴菌多糖對(duì)羥基自由基的清除率。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)干巴菌多糖提取率的影響(圖1)

圖1 料液比對(duì)干巴菌多糖提取率的影響

從圖1可以看出，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，干巴菌多糖提取率最高。因此，確定最佳料液比為1∶15。

2.1.2 提取溫度對(duì)干巴菌多糖提取率的影響(圖2)

圖2 提取溫度對(duì)干巴菌多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

從圖2可以看出，隨著提取溫度的升高，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，干巴菌多糖提取率最高；繼續(xù)升高提取溫度，多糖提取率反而下降。因此，確定最佳提取溫度為60 ℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)干巴菌多糖提取率的影響(圖3)

圖3 提取時(shí)間對(duì)干巴菌多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，干巴菌多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)提取時(shí)間為2.0 h時(shí)，干巴菌多糖提取率達(dá)到最高；繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖提取率反而下降。因此，確定最佳提取時(shí)間為2.0 h。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of orthogonal experiments

由表2可知，各因素對(duì)干巴菌多糖提取率的影響不同，提取溫度對(duì)多糖提取率的影響最大，其次是提取時(shí)間，料液比對(duì)多糖提取率的影響相對(duì)較小。綜合考慮，確定最佳提取工藝條件為A3B3C2(實(shí)驗(yàn)9#)，即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.5 h、料液比1∶15，在此條件下，多糖提取率為10.08%。

2.3 干巴菌多糖的抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除率(圖4)

圖4 干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of DPPH free radicals by polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

從圖4可以看出，干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨多糖濃度增加而升高；當(dāng)濃度為5 mg·mL-1時(shí)，干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到86.99%，略低于VC。干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率有效質(zhì)量濃度(IC50)為1.91 mg·mL-1。

2.3.2 對(duì)羥基自由基的清除率(圖5)

圖5 干巴菌多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of hydroxyl free radicals by polysaccharides from Thelephora ganbajun Zang

從圖5可以看出，干巴菌多糖對(duì)羥基自由基的清除率隨多糖濃度增加而升高；當(dāng)濃度為5 mg·mL-1時(shí)，干巴菌多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到87.46%，略低于VC。干巴菌多糖對(duì)羥基自由基的IC50為2.25 mg·mL-1。

2.4 討論

多糖是由超過10個(gè)、幾百甚至幾千個(gè)單糖分子聚合而成的一類化合物，廣泛分布于自然界中，是一類重要的活性物質(zhì)。多糖由于其分子中含有大量極性基團(tuán)，對(duì)水分子具有較大的親和力[11]。一些分子量較小、分支程度較低的多糖在水中有一定溶解度，因此，水提取法是提取植物多糖最常用的方法?？妶@欣等[12]從鐵皮石斛花中提取多糖，在超聲時(shí)間為55 min、料液比為1∶50、微波時(shí)間為 3 min的條件下，多糖提取率為7.22%。鐘麗霞等[13]從山楂中提取多糖，在提取溫度為63 ℃、微波功率為500 W、提取時(shí)間為7 min的條件下，多糖提取率為14.71%。本研究采用熱水法提取干巴菌多糖，多糖提取率為10.08%，介于兩者之間。

人體因?yàn)楦鞣N因素，體內(nèi)不斷地產(chǎn)生自由基，研究表明，癌癥、衰老或其它疾病大都與過量自由基的產(chǎn)生有關(guān)。測(cè)定對(duì)自由基的清除能力是評(píng)價(jià)抗氧化活性的主要方法。王白娟等[14]研究了大紅菇多糖的抗氧化活性，在大紅菇多糖濃度為0.4 mg·mL-1時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)68.74%、對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)61.80%，與同濃度的VC的清除率相當(dāng)。本研究中干巴菌多糖濃度較低時(shí)，抗氧化活性比VC低，當(dāng)多糖濃度達(dá)到5 mg·mL-1時(shí)，干巴菌多糖的抗氧化活性略低于VC。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了干巴菌多糖的提取工藝，并通過測(cè)定干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基及羥基自由基的清除率來評(píng)價(jià)其抗氧化活性。確定干巴菌多糖的最佳提取工藝條件為：提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.5 h、料液比1∶15(g∶mL)，在此條件下，多糖提取率達(dá)到10.08%。該方法對(duì)干巴菌多糖的提取具有一定的參考價(jià)值。干巴菌多糖對(duì)DPPH自由基及羥基自由基均具有較好的清除效果，當(dāng)干巴菌多糖濃度為5 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別達(dá)到86.99%、87.46%。