玉米轉基因成分篩查策略

溫洪濤 李夏瑩 楊洋 陳子言 丁一佳 張秀杰 張瑞英

（1. 黑龍江省農業科學院農產品質量安全研究所，哈爾濱 150086；2. 農業農村部科技發展中心，北京 100176）

2018 年全球轉基因作物種植面積已達1.917 億hm2，其中玉米面積僅次于大豆，占5 890 萬hm2［1］。據國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）統計，目前全球已商業化的31 種轉基因作物的轉化體數量已達到517 種，其中玉米轉化體237 種［2］，超過1/3，其種類最多也最復雜。不斷涌現的新型轉基因玉米品系給監管工作帶來了巨大挑戰。

在轉基因作物商業化的二十幾年間，雖然針對轉基因成分的篩查已經開發出如酶聯免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列依賴性擴增（Nuleic and sequerce based amplipicain，NASBA）、重組酶聚合酶擴增（Recombinase polymerase amplification，RPA） 等 大量的新型檢測技術，但從成本、適用性、準確性與通量等多方面綜合考慮，目前世界范圍內主流的轉基因檢測手段依然是傳統的、以核酸為目標的PCR方法［3-6］。

面對復雜的玉米轉化事件，近年來一些研究機構有針對性的研發出基于PCR 方法的篩查策略。張海波等［7-8］分別使用定性和定量PCR 方法建立了以P-CaMV35S 和T-NOS 序列為目標的轉基因玉米定性檢測方法，吳明生等［9］研發了以P-CaMV35S、T-NOS和Bar 基因為目標的轉基因玉米三重實時熒光PCR檢測方法；Frederic 等［10］測試了6 種啟動子和4 終止子在不同轉基因作物中的特異性，包含7 種不同的玉米轉化體。

當前，絕大多數篩查策略均以P-CaMV35S 和T-NOS 為主要目標序列，這是由于它們是目前轉基因產品中使用率和覆蓋度最高的兩種元件［11］，然而為了提高啟動子的效率，P-CaMV35S 一直在不斷被改造，許多研究人員詳細比對過不同類型的P-CaMV35S，并對已有的特異性引物進行了驗證，這些研究結果顯示大量轉化事件中所用的P-CaMV35S 序列都不完全一致的，這種差異造成相同的引物在不同轉化事件中檢測效率有很大不同，有時會嚴重影響對檢測結果的判定［12-14］。所有常見的轉基因元件和功能基因在不同轉化事件中都存在這種序列差異問題，因此為了使檢測結果更加真實可靠，有必要在進行篩查策略研發的時候對轉基因材料進行實驗室驗證工作，而不僅僅是對數據的分析整理。本研究基于此目的，利用常見的9 種目標元件或基因對32 種玉米轉化事件進行了實時熒光PCR 方法的驗證，同時還開發出了可配套使用的陽性質粒分子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本研究共使用了32 種轉基因玉米材料，具體信息見表1。

快速質粒小提試劑盒 康為世紀；DNeasy Plant Mini Kit 植物DNA 提取試劑盒 Qiagen 公司；內切酶 NEB 公司；質粒合成 通用公司；iTaq Universal Probes Supermix 實 時 熒 光PCR 試 劑 盒 及PCR 板 Bio-Rad 公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 數字PCR 芯片套裝、QuantStudioTM3D Digital PCR Master Mix v2 數字PCR 酶試劑盒 Thermo Fisher Scientific 公司。Easy Dilution TAKARA 公司。

表1 轉基因材料來源

1.1.2 儀器與設備 Nanodrop ND-2000 核酸定量儀、QuantStudio 7 實 時 熒 光PCR 儀、ProFlex PCR 儀、QuantStudioTM3D 數字PCR 儀 Thermo Fisher Scientific公司；VX-200 旋渦混勻儀 Labnet 公司；5424R 臺式離心機 Eppendorf 公司；H2O3-PRO 金屬浴 北京卡尤迪公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 轉基因材料的基因組DNA 提取方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 元件/基因的確定 查詢ISAAA、轉基因檢測 數 據 庫（GMDD，http：//gmdd.sjtu.edu.cn/）、 改性活性生物體登記數據庫（LMO，http：//bch.cbd.int/database/organisms/）等網站提供的信息，對已經商業化及可能商業化的玉米轉化體進行分子特征的分析研究，比對各種元件和基因出現的頻率。

1.2.3 引物及探針 實時熒光PCR 方法和普通PCR相比其特異性更高，反應后不需要電泳檢測，能有效的避免出現污染，加之可以使用384 通道，使其通量和效率得到極大提升，隨著試劑耗材成本的下降，未來必將逐漸取代普通PCR 成為主流檢測手段，因此本研究方案中全部使用實時熒光PCR 方法。結合日常檢測中的實驗數據，最終選出了同一種元件/基因中覆蓋范圍更廣、適用性更高的引物探針組合。本研究中所涉及的引物和探針均由Thermo Fisher Scientific 公司合成，具體序列及所使用的熒光標記見表2，所有探針5′端用6-羧基熒光素（FAM）標記，3′端用黑洞猝滅基團（BHQ1）標記。

1.2.4 實時熒光PCR 反應體系和程序 總體系為15 μL，其中iTaq Universal Probes Supermix 7.5 μL、正向引物0.5 μmol/L、反向引物0.5 μmol/L、探針0.25 μmol/L、模板DNA 為每個反應體系中50 ng，用雙蒸水將總體積補足至15 μL；反應程序為95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸60 s，共40 個循環；在第二階段的退火延伸（60℃）時段收集熒光信號。

表2 引物和探針信息

1.2.5 陽性質粒構建 根據查詢數據庫獲得的P-CaMV35S、T-NOS、Bar基 因、Pat基 因、Cp4-epsps基因、NPTⅡ基因、cry1A基因、P-Rice actin、phy 結構特異性片段連同玉米內標基因zSSIIb共10種目標元件/基因的序列，經過人工合成并克隆到質粒載體pUC18 中。

1.2.6 陽性質粒測序及純度驗證 將重組質粒轉運至大腸桿菌感受態細胞中，挑取單克隆測序驗證后提取質粒。用紫外分光光度法測定 純化后的質粒在 A230、A260和A280處的吸光值。純凈dsDNA 的A260/A280應為1.8-2.0，而A260/A230應在2.0 左右。

1.2.7 陽性質粒數字PCR 拷貝數測試 將陽性質粒進行梯度濃度稀釋，使用數字PCR 進行拷貝數定量，數字PCR 反應包括5 個步驟：體系配制、樣品加載及芯片密封、PCR 擴增、芯片讀取及分析。反應體系為：1×3D Digital PCR Master Mix v2，正反向引物終濃度均為0.50 μmol/L，探針終濃度0.27 μmol/L，模板DNA 2 μL，雙蒸水補足至14.5 μL。配置好的體系通過上樣儀自動加載到芯片各微孔中，體系加載完成后使用Immersion Fluid 覆蓋芯片表面并將芯片密封，將芯片放置于平板PCR 儀上進行擴增。擴增程序：96℃，10 min 預變性；98℃變性30 s，60℃退火2 min，共40 個循環。

1.2.8 陽性質粒實時熒光PCR 可替代性測試 將數字PCR 驗證過的質粒進行實時熒光PCR 可替代性測試，反應程序和體系見1.2.4。

2 結果

2.1 篩查元件/基因的確定

經過數據庫的查詢和比對，共發現237 種玉米轉化體，其中包含53 種獨立性狀轉化體和184 種復合性狀轉化體；同時，據統計我國處在申請安全證書和和生產性試驗階段的轉基因玉米轉化體數量已達到48 種，國內外總計有285 種轉化體。

通過對元件/基因使用率及國內外檢測標準方法的研究，最終確定了9 個外源元件/基因的篩查策略，分別是：P-CaMV35S、T-NOS、Bar基因、Pat基因、Cp4-epsps基因、NPTⅡ基因、cry1A基因、P-Rice actin、phy 結構特異性片段，按照數據庫提供的信息推測，使用這9 種元件/基因策略可以篩查出包括復合性狀在內的261 種轉基因玉米，覆蓋了全部285 種玉米轉化體的91.6%。

2.2 實時熒光PCR方法對不同轉基因玉米材料的篩查測試

為驗證9 種元件/基因篩選策略是否適合對玉米中的轉基因成分進行篩查，利用表2 中所述引物探針對實驗室前期收集到的32 種玉米轉化體進行驗證。首先提取32 種材料的DNA，根據其標注含量進行稀釋，使DNA 溶液中轉基因成分的相對含量全部達到1%，之后進行實時熒光PCR 實驗，測試結果見表3。

表3 中1-20 號玉米轉化體樣品已獲得我國發放的轉基因生物安全證書，從測試結果中可以看出，除DAS-40278-9 外其余19 種轉化體可以被9 種元件的篩查方法完全覆蓋；21-32 號樣品尚未獲得我國發放的生物安全證書，其中21-24 號為國外商業化轉化體，25-32 號為國內研發、處于申請證書或生產性試驗階段的轉化體，其中VCO-01981-5 無法被本篩查方法覆蓋。

2.3 篩查陽性質粒分子的構建和驗證

將10 種元件/基因人工合成并克隆到pUC18 載體中，獲得篩查用陽性質粒分子pYMSC-1905（圖1），其總長度為6 808 bp，由合成公司經測序驗證與設計序列相符，且10 種目標片段比值均為1。提取純化質粒分子獲得了50 ng/μL 的樣品并在Nanodrop ND-2000 上進行檢測，其A260/A280值為1.81，A260/A230為2.01，均符合紫外分光光度測試對DNA 純度的相關要求。

2.4 篩查陽性質粒分子數字PCR拷貝數測試

經過初步計算和評估，將獲得的質粒陽性DNA樣品進行梯度稀釋，使用10 種引物探針組合對其進行拷貝數測試，最終顯示10 種目標序列均獲得了良好的結果，其有效反應孔數在15 000-17 000 cp/μL（圖2），符合數字PCR 反應的相關參數要求，檢測出的陽性質粒分子濃度在600-1 000 cp/μL（表4）。

表3 不同轉基因玉米材料的篩查測試結果

圖1 玉米轉基因成分篩查陽性質粒pYMSC-1905 圖譜

2.5 篩查陽性質粒分子實時熒光PCR可替代性 測試

將數字PCR 測試的同一質粒樣品進行實時熒光PCR 反應的可替代性測試，其檢測均獲得了正常的擴增曲線（圖3），結果Ct 值均在36 以下（表5），與測試出的拷貝數具有良好的一致性，表明其可用作實時熒光PCR 檢測的陽性對照使用。

3 討論

截 止2019 年11 月， 我 國 對 植 酸 酶 玉 米BVLA430101 發放了生產用安全證書，并且對20 種國外玉米轉化體發放了進口用作加工原料安全證書，其中包括本次實驗未參與驗證的Bt11 X GA21，這21 種轉化體中除DAS-40278-9 外均可以被本方法 覆蓋。

圖2 陽性質粒分子3D-dPCR 驗證熒光信號

表4 陽性質粒分子3D-dPCR 驗證結果

圖3 陽性質粒分子實時熒光PCR 驗證信號

表5 陽性質粒分子實時熒光PCR Ct 值

在轉基因作物的研發過程中，為使外源基因適合在宿主植物中進行表達，經常需要根據宿主密碼子的偏好對目標元件的密碼子進行修飾，從而造成相同名稱的基因不一定具有完全相同的核苷酸序列。因此，在設計檢測方法時必須考慮同名的基因元件其DNA 序列是否有差異，檢測靶標在不同轉化事件中是否一致，能否用同樣的引物進行檢測。

Cry1A基因由于被改造和使用的最多，其情況最為復雜，包含了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A105等多種同源基因，本次篩查中選用的引物和探針組合可以特異性的檢出MON810、Bt176 等常見轉化體，但無法檢出Bt11，這是在日常檢測中需重點關注的問題。MON87427 在ISAAA 數據庫中顯示包含Cp4-epsps基因，但測試結果中并未出現陽性結果，我們將其序列與I 型Cp4-epsps基因進行了比對，發現其同源性有較大的差異（結果未列出），而這在各數據庫中并未有提示，容易給依賴目標名稱和數據庫信息進行日常檢測的機構帶來誤判。

本研究中構建的篩查質粒按照理論計算獲得的數值與數字PCR 實際測試結果具有較大的差異，推測這可能是由質粒分子本身結構造成的，在實際應用中一般傾向于以數字PCR 測試值為準。由于該質粒的研發目的是作為定性檢測的陽性物質，其量值的準確性及均勻性并未進行進一步測試，這也是后續工作的重點研究內容。

4 結論

建立了以9 種常用元件/基因為目標的基于實時熒光PCR 技術的玉米轉基因篩查方法，可覆蓋30種獨立性狀玉米轉化體，同時研制了可與該方法配套使用的陽性質粒分子。