轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性PCR 方法驗證結果分析

王顥潛 肖芳 楊蕾 繆青梅 張旭冬 張秀杰

（1. 農業農村部科技發展中心，北京 100176；2. 中國農業科學院油料作物研究所，武漢 430062；3. 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021）

隨著轉基因生物技術的不斷發展，全球轉基因作物種植面積持續增長，已從1996 年的170 萬hm2增加到2018 年的1.917 億hm2，產生了巨大的社會效益和經濟效益［1］。大力發展轉基因生物技術，培育優良轉基因品種已成為各國保障農業可持續發展的趨勢。生物技術產業的健康發展，離不開健全的轉基因生物安全監管制度。為了有效的監管轉基因生物，保護消費者的知情權，包括我國在內的全球60 多個國家和地區相繼頒布實施了轉基因生物安全管理制度、標識管理制度以及配套的辦法規定 等［2-3］。2001 年以來，我國先后頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》《農業轉基因生物安全評價管理辦法》《農業轉基因生物進口安全管理辦法》等配套規章制度，對農業轉基因生物的試驗研究、生產、加工、標識、進口等環節進行全過程嚴格管理。轉基因生物安全的跟蹤監管必須以有效的檢測方法為基礎。針對商業化生產或國內批準安全證書的轉基因產品建立特異、靈敏、標準化的檢測方法是落實轉基因生物安全管理制度的重要保障，更是我國轉基因生物安全監管工作的重要技術支撐。

據國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）統計，目前全球已批準商業化種植31 種轉基因作物，共涉及517 種轉化體，其中玉米轉化體237 種，是獲得商業化批準最多的轉基因作物［4］。玉米作為中國重要的糧食及飼料作物之一，是國內轉基因研發領域的重點。我國自2008 年啟動實施轉基因重大專項以來，自主基因、自主技術、自主品種的研發能力顯著提升，研發出一批具有商業化應用前景的轉基因作物品種。2020 年1 月21 日，農業農村部發布2019 年農業轉基因生物安全證書（生產應用）批準清單，其中包括2 個玉米品種和1 個大豆品種。這是2009 年轉基因抗蟲水稻“華恢1 號”、“Bt 汕優63”和轉基因植酸酶玉米“BVLA430101”獲得轉基因生物安全證書之后，又有主要農作物品種獲批。特別是“十三五”國家科技創新規劃提出“占領制高點、推進產業化”的戰略目標，我國轉基因玉米產業化進程將進一步加快，加之申請進口安全證書的國外轉基因產品也越來越多，我國轉基因生物安全監管的任務也將越來越重，對于轉基因檢測方法的要求也越來越高。

抗蟲和耐除草劑玉米雙抗12-5（瑞豐125）是本次獲批的玉米品種之一，該品種由浙江大學采用農桿菌介導方法轉化而成，轉入獨立發掘的抗蟲基因和耐草甘膦基因，表現出良好的抗蟲性和除草劑（農達）耐受性，具有廣闊的應用前景。未來，轉基因玉米雙抗12-5 的成功推廣和應用，離不開有效的轉基因安全監管。為此，我們組織了8 家實驗室：吉林省農科院（編號1）、山東省農科院（編號2）、浙江省農科院（編號3）、中國農科院植保所（編號4）、中國農科院生物所（編號5）、中國農科院棉花所（編號6）、農業農村部天津環保所（編號7）、天津市農科院（編號8），對研發單位提供的轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性和定量PCR 方法進行了實驗室間驗證，并參照農業部2259 號公告-4-2015［4］、農業部2259 號公告-5-2015［5］及專家認定的驗證方案對檢測方法進行評價與分析，為后續標準方法的建立和轉基因生物安全監管提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性、定量PCR 方法循環驗證所涉及的共13 種樣品（包括7 種單一組分樣品、6 種混合樣品，見表1）。其中，涉及定性PCR 方法的有10 種樣品，涉及定量PCR 方法的有12 種樣品，陽性對照、陰性對照和特異性檢測樣品在定性和定量PCR 檢測方法驗證中共用。以上樣品均由農業農村部科技發展中心統一提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 參照《轉基因植物及其產品成分檢測DNA 提取和純化》（農業部1485 號公告-4-2010）［6］執行。每個樣品提2 份DNA，每份DNA 做3 次平行。將所有樣品研磨成粉末，按照植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書，提取樣品基因組DNA，使用紫外分光光度計對DNA 樣品濃度和純度進行測定，確認OD260/280比值在1.7-2.0 之間，再用0.1×TE 緩沖液將純化的DNA 溶液稀釋至終濃度25 ng/μL，4℃冷藏保存備用。

1.2.2 引物設計 根據雙抗12-5 研發單位提供的技術資料，轉化體特異性定性PCR 引物為：F ：5′-CAACGTCGTGACTGGGAAAA-3′，R ：5′-TGGAAGACAAGTTCTACGGGCT-3′， 擴 增 產物大小為256 bp。轉化體特異性定量PCR 引物為：F ：5′-GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT-3′，R ：5′-GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA-3′，P：FAMAGCTCAACCACATCGCCCGACGC-BHQ1，擴增產物大小為94 bp。定性PCR 和定量PCR 引物位置見圖1。

表1 樣品信息表

圖1 定性PCR 和定量PCR 引物位置示意圖

1.2.3 定性PCR 反應 根據雙抗12-5 研發單位提供的技術資料，定性PCR 反應程序：94℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35 次循環；72℃延伸7 min。定性PCR 反應體系見表2。

1.2.4 定量PCR 反應 根據雙抗12-5 研發單位提供的技術資料，定量PCR 反應程序為：95℃變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，共進行50 次循環；在第二階段的退火延伸（60℃）時段收集熒光信號。定量PCR 反應體系見表3。

表2 雙抗12-5 轉化體特異性定性PCR 檢測反應體系

表3 雙抗12-5 轉化體特異性定量PCR 檢測反應體系

1.2.5 建立標準曲線 提取雙抗12-5 樣品中的基因組DNA，用0.1×TE 緩沖液按照1∶5 稀釋成5 個拷貝數梯度為3.6×104、7.2×103、1.44×103、2.8×102和5.7×101的標準溶液，分別進行zSSIIb內標準基因和雙抗12-5 轉化體的實時熒光定量PCR，每個梯度設置3 個平行。以模板拷貝數的對數值為橫坐標，以Ct 值為縱坐標建立雙抗12-5 和zSSIIb內標準基因的標準曲線，并得到標準曲線公式：（n：模板拷貝數，y：測試樣品的Ct 值，a：標準曲線的斜率，b：標準曲線的截距）。實時熒光定量PCR 體系及程序見1.2.3，玉米內標基因zSSIIb的引物為：zSSIIb-F：5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3′，zSSIIb-R：5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3′，zSSIIb-P：FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTGBHQ1，擴增產物大小為88 bp。

1.2.6 定量PCR 方法準確性測試 對質量分數為5%和0.5%的準確性樣品分別進行定量PCR，每個樣品做3 次平行，重復2 次試驗。根據測定出的Ct 值，按照標準曲線公式計算出式樣中雙抗12-5 轉化體和zSSIIb內標基因的模板拷貝數，再根據下面公式［7］計算樣品中轉基因成分的含量：

2 結果

2.1 定性PCR方法循環驗證結果

按照上述定性PCR 反應體系，用雙抗12-5 轉化體特異性定性引物擴增相應的待測樣品。經8 家實驗室驗證結果顯示，在定性PCR 方法特異性檢測中，所有實驗室均從含有雙抗12-5 樣品中擴增出其轉化體特異性序列，且片段大小與預期一致，在其他轉基因玉米混樣、轉基因大豆混樣、轉基因棉花混樣、轉基因水稻混樣、轉基因油菜混樣、非轉基因玉米混樣和陰性樣品中均未擴增出雙抗12-5 轉化體特異性序列；在靈敏度檢測中，所有實驗室均從質量分數為0.1%的雙抗12-5 樣品中擴增出其轉化體特異性序列，且片段大小與預期一致，以3 號實驗室的結果為例，見圖2。8 家實驗室具體驗證結果見表4。綜上說明，研發單位提供的轉基因玉米雙抗12-5轉化體特異性定性PCR方法具有良好的特異性，檢測靈敏度達到0.1%。

圖2 轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性PCR 方法的靈敏度檢測

表4 轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性PCR 方法驗證結果匯總表

2.2 實時熒光定量PCR方法循環驗證結果

2.2.1 特異性及靈敏度檢測 按照上述定量PCR 反應體系，用雙抗12-5 轉化體特異性定量引物擴增相應的待測樣品。由于第4 家實驗室空白對照中有明顯的擴增信號，將該實驗室驗證結果列為異常數據剔除。在定量PCR 方法特異性檢測中，7 家實驗室均從含雙抗12-5玉米轉化體的樣品中獲得擴增信號，而在其他轉基因玉米混樣、轉基因大豆混樣、轉基因棉花混樣、轉基因水稻混樣、轉基因油菜混樣、非轉基因玉米混樣和陰性樣品中均未獲得擴增信號；在靈敏度檢測中，7 家實驗室均從質量分數為0.05%的雙抗12-5 樣品中獲得擴增信號。8 家實驗室具體驗證結果見表5。

表5 轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定量PCR 方法驗證結果匯總表

綜上說明，研發單位提供的轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性實時熒光定量PCR 檢測方法具有良好的特異性，檢測靈敏度達到0.05%。

2.2.2 標準曲線的建立及擴增效率測試 對8 家實驗室建立的雙抗12-5 轉化體和zSSIIb內標基因的標準曲線數據匯總分析，具體如下：內標基因zSSIIb的標準曲線斜率范圍在-3.572--3.128 之間，平均值為-3.309。根據斜率計算的PCR 擴增效率為90.55%-108.75%之間，平均值為100.94%，符合農業部標準［5］中大于90%和小于110%的要求。決定系數R2值均大于0.98，平均值為0.996，符合農業部標準［5］中大于0.98 的要求；雙抗12-5 轉化體的標準曲線斜率范圍在-3.569-3.127 之間，平均值為-3.372。根據斜率計算的PCR 擴增效率為90.65%-108.85%之間，平均值為98.36%，符合農業部標準［5］大于90%和小于110%的要求。決定系數R2值均大于0.98，平均值為0.996，符合農業部標準［5］大于0.98 的要求。具體數據見表6。

表6 玉米內標基因zSSIIb 和雙抗12-5 的擴增效率及標準曲線決定系數

綜上，8 家實驗室的雙抗12-5 轉化體和zSSIIb內標基因檢測體系的擴增Ct 值與模板拷貝數間均存在良好的線性關系，所建立的標準曲線均可用于定量PCR 結果分析。

2.2.3 準確性測試 將8 家實驗室提供的數據和結果進行匯總分析，采用科克倫（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法對測試結果進行異常值檢驗，在實驗室數量為8、置信區間為5%的條件下，科克倫檢驗和格拉布斯檢驗的臨界值分別為：0.680 和2.126［8］，分別計算8 家實驗室的科克倫統計量C 值和格拉布斯統計量G 值［8］。經計算，5%質量分數樣品中1 號實驗室的G 值和6 號實驗室的C 值大于臨界值，為2 組異常值，0.5%質量分數樣品無異常值。剔除異常值后，計算出每個實驗室2 份準確性樣品的測量平均值，得出測量值與真值的偏差（Bias），6 家實驗室5%樣品測試值與真值的偏差的范圍在-8.30%-0.40%之間，8 家實驗室0.5%樣品測試值與真值的偏差的范圍在-10.0%-62.0%之間（見圖3）。綜合8 家實驗室中的有效數據計算5%和0.5%準確性樣品的測量平均值分別為4.88%和0.61%，偏差分別為2.47%和21.38%，大多數的偏差主要是正值，具體數據見表7。質量分數為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品的偏差小于25%。驗證結果表明，雙抗12-5 定量方法能準確地定量檢測質量分數為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品。

圖3 8 家實驗室測量值與真值相對偏差示意圖

2.2.4 重復性和再現性 根據剔除異常值后的準確性樣品測試結果，計算8 家實驗室內重復性相對標準偏差（RSDr值）和實驗室間再現性的相對標準偏差（RSDR值），見表8。8 家實驗室定量檢測質量分數為5%、0.5%雙抗12-5 樣品的RSDr值均介于1.13%-20.20%之間，符合農業部標準中RSDr ≤ 25%的要求［5］，說明該方法在實驗室內具有良好的重復性；8 家實驗室定量檢測質量分數為5%、0.5% 雙抗12-5 樣品的RSDR值分別為4.52%、18.43%，符合農業部標準中RSDR≤ 35%的要求［5］，說明該方法在實驗室間具有良好的再現性。

3 討論

目前，轉基因產品的檢測方法主要分為兩類：基于外源核酸的檢測技術和基于外源蛋白的檢測技術［9］。由于核酸在提取、保存及穩定性方面的優勢，使得基于核酸的檢測方法在轉基因產品檢測中得到快速發展。根據檢測靶標的不同，基于核酸的檢測方法分為篩查檢測、基因特異性、構建特異性檢測和轉化體特異性檢測4 種類型［10］。轉化體特異性檢測方法以外源插入序列與植物基因組的連接區為檢測靶標，不僅能檢出轉入基因序列，還可判定待測樣品的轉基因作物品系，具有高度特異性，是國內外轉基因產品檢測標準建立的主要方法［11-12］。基于核酸的檢測方法有普通定性PCR、實時熒光定量PCR、多重復合PCR［13］、數字PCR［14］、重組聚合酶擴增（RPA）［15］、環介導等溫擴增技術PCR 方法［16］等，其中定性PCR、實時熒光定量PCR 應用最為廣泛［17］。中國的轉基因產品檢測標準以定性PCR 方法為主，而歐盟聯合實驗室則以實時熒光定量PCR 方法為主［18］。定性PCR 操作相對簡單，儀器和試劑成本較低，但是相應的分辨率低，只可以做定性判斷。實時熒光定量PCR 相對準確靈敏，不僅可以定性，而且可以判斷轉基因成分準確含量，但儀器和成本大幅提高，且需要制備標準品。

表7 準確性樣品的測試結果

表8 RSDr 值和RSDr 值計算結果

本研究對2020 年獲得安全證書的轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性、定量PCR 方法進行驗證和評價。雙抗12-5 轉化體特異性定性PCR 方法從特異性和靈敏度等指標進行驗證，結果顯示，該方法能從含有雙抗12-5 的樣品中特異性地檢測出預期片段，而在Bt11 等19 種其他轉基因玉米混合樣、GTS40-3-2 等14 種轉基因大豆混合樣、TT51-1 等8種轉基因水稻混樣、MON1445 等7 種轉基因棉花混樣、MS1 等10 種轉基因油菜混樣中未檢出雙抗12-5轉化體成分，有效區別其他常見轉基因品種，未出現假陽性和非特異性條帶，具有高度特異性，檢測靈敏度可以穩定達到0.1%，而且8 家實驗室驗證結果一致，表明方法有較好的實驗室間再現性。

雙抗12-5 轉化體特異性定量PCR 方法從特異性、靈敏度、準確性、精密度等指標來進行驗證和評價。驗證結果顯示，雙抗12-5 轉化體特異性定量PCR 具有高度特異性，且檢測靈敏度可以穩定達到0.05%。準確性是評價方法的基本要求，我們對8 家實驗室建立的標準曲線進行了分析，雙抗12-5 的標準曲線斜率范圍在-3.569--3.127 之間，擴增效率在90.65%-108.85%之間，R2值均大于0.98，說明模板的量和Ct 值有很好的相關性，均滿足定量分析的要求［5］。采用科克倫（Cochran）法和格拉布斯（Grubbs）法剔除異常值后，得出5%、0.5%準確性樣品對應的測量平均值分別為4.88%、0.61%，偏差分別為2.47%、21.38%，表明雙抗12-5 定量方法能準確地定量檢測質量分數為5%和0.5%的樣品，具有較好的準確性。精密度是用來表示測試結果之間的接近程度，精密度越高，說明各次測量數據比較接近［19］。RSDr 值和RSDR值是反映方法精密度的重要指標［8］。8 家實驗室RSDr 值均介于1.13%-20.20%之間，兩個準確性樣品的RSDR值分別為4.52%、18.43%，精密度符合要求［5］，說明該方法具有良好的重復性和再現性。

4 結論

本研究組織了8 家實驗室對我國新批準安全證書的轉基因玉米雙抗12-5 轉化體特異性定性、定量PCR 方法進行了循環驗證，驗證結果表明定性與定量PCR 檢測方法均具有穩定性好、特異性強和靈敏度高的特點，定量PCR 方法能精確地定量檢測質量分數為5%和0.5%的雙抗12-5 樣品，并且具有良好的重復性和再現性。本研究有助于后續標準方法的建立和完善，為我國轉基因生物安全監管提供技術支撐和決策依據。