PRRSV NADC30-like SYBR Green I qPCR 檢測方法的建立與應用

項明源 廖倡宇 江地科 張鵬飛 王印 羅燕 楊澤曉 姚學萍

（1. 四川農業大學動物醫學院，成都 611130；2. 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinere productive and respiratorysyndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）引起的一種病毒病。它以母豬發熱、厭食和流產、死產、產弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征［1］。1996 年我國首次報道了PRRS［2］，毒株為以CH-1a、BJ-4 株等為代表的經典PRRSV；在2006 年出現了高致病PRRSV 變異株［3］，并迅速成為優勢流行毒株，代表株為JXA1、HuN4 和JXwn06 等；在2013 年發現了PRRSV 的新毒株與美國的NADC30 毒株具有較高的同源性，因此稱為PRRSV NADC30-like［4］。近幾年在中國吉林、黑龍江、河南、北京、天津、山西和浙江等地相繼報道PRRSV NADC30-like 毒株爆發。隨著臨床檢出率大幅提高，NADC30-like 逐漸成為PRRSV 主要流行毒株［5-6］，給中國養豬業造成了嚴重的經濟損失。目前已有多個PRRSV 檢測方法，如溫青娜［7］等基于qPCR 建立了鑒別歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV 檢測方法，但尚無基于SYBR Green I qPCR 鑒定NADC30-like 毒株的方法，毒株類型確定還需依靠ORF5 序列測定和分子進化樹分析［8］，這需要更高技術要求和更長時間得出結果。

本研究基于NADC30-Like 毒株在Nsp2 基因存在“111+1+19”aa 氨基酸不連續缺失且該種缺失在PRRSV 基因分類使用時極為保守的特點［9］，自行設計特異性引物，建立了鑒定PRRSV NADC30-Like 毒株熒光定量PCR 方法。面對國內多種類型PRRSV毒株共存的局面，該方法較于探針法有更低的價格，較于普通PCR 有更高的靈敏度而在市場中更容易推廣，可快速、精確鑒定出PRRSV NADC30-Like 毒株，旨為臨床診斷提供快速、精確的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及疫苗 高致病性豬呼吸與繁殖綜合征活疫苗（HuN4-F112 株）、豬瘟活疫苗（兔源）購自上海海利公司，PRRSV NADC30-like、豬圓環2 型病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬輪狀病毒均由四川農業大學動物醫學院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室 保存。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α 購自北京天根公司；T-Vector pMD19（Simple）購自大連TakaRa 公司；AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix 購自南京諾唯贊公司；病毒基因組DNA 提取試劑盒、病毒基因組RNA 提取試劑盒、DNA 膠回收純化試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天根公司；1×T3 Super PCR Mix 購自成都擎科梓熙公司；氨芐青霉素購自美國Amresco 公司；T4 連接酶、Prime Script TMRTReagent Kit 購自大連TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據NCBI GenBanK 中PRRSV NADC30-like（登錄號：JN654459）的Nsp2基因序列，使用Snapgene 3.2.1 軟件自行設計特異性引物，上游引物P1-F：5′-TCCAGGTGTGGTAGTTT- GGT-3′，下游引物P1-R：5′-GGGACAGGCACAGGTTCATT-3′，預期擴增片段大小為131 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 熒光定量PCR 標準品的制備 以病毒基因組RNA 提取試劑盒提取PRRSV NADC30-like 的RNA，用反轉錄試劑盒制備出cDNA，用引物P1-F 和P1-R進行PCR 擴增，通過DNA 純化回收試劑盒進行膠回收，連接pMD19-T 載體，轉化DH5α 感受態細胞，將經過PCR 鑒定并且測序正確的重組質粒用以配制標準品，在配制之前用核酸蛋白檢測儀測定其濃度并換算成拷貝數，作為熒光定量PCR 的標準品。

1.2.3 熒光定量PCR 樣品的制備 用病毒基因組DNA 提取試劑盒和病毒基因組RNA 提取試劑盒分別提取豬圓環2 型病毒、豬偽狂犬病病毒、高致病性豬呼吸與繁殖綜合病毒、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒的DNA或者制備其cDNA 作為熒光定量PCR 反應的模板，于-20℃保存備用。

1.2.4 熒光定量PCR 反應條件的優化及標準曲線的繪制 以標準品作為模板進行反應條件的優化，改變引物終濃度（2-20 μmol/L），同時改變退火溫度（52-62℃），通過不同條件的反應對反應體系與條件進行優化。最終，以最佳反應條件與體系進行反應，延伸時檢測熒光信號，確定最佳引物的反應終濃度。以ddH2O 將標準品以10 倍系列稀釋成10 成個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中6 梯度（2.25×107-2.25×102copies/μL）的標準品分別作為模板，每個濃度度設立3 個重復，同時設立陰性對照，以最佳反應條件進行擴增。反應結束后，利用ABI 7500 Software v2.0.1 分析軟件自動生成擴增動力學曲線與標準曲線。

1.2.5 靈敏度實驗 將制備的初始濃度標準品10 倍稀釋至2.25×10-2copies/μL，以梯度稀釋的質粒為模板，按最佳反應條件進行靈敏度實驗。使用同樣的模板和引物進行普通PCR 檢測，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.6 特異性實驗 利用上述所提取的病毒的DNA或cDNA 分別作為樣品模板，以引物P1-F 和P1-R進行熒光定量PCR 檢測，同時設立陰性對照，用最佳反應條件與體系進行擴增，根據擴增曲線評價此反應的特異性。

1.2.7 重復性實驗

1.2.7.1 批內重復實驗 將制備的初始濃度標準品以10 倍系列稀釋成10 個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中3 個稀釋度的DNA 樣品作為模板。每個稀釋度做4 個重復，以最佳反應條件進行1 次熒光定量PCR 反應，根據每個稀釋度的Ct 值計算批內變異系數（CV）。

1.2.7.2 批間重復實驗 將制備的初始濃度標準品以10 倍系列稀釋成10 個梯度（2.25×1010-2.25×101copies/μL），取其中3 個稀釋度的DNA 樣品作為模板。以最佳反應條件進行4 次熒光定量PCR 反應，根據每個稀釋度的Ct 值計算批間變異系數（CV）。以批內、批間的變異系數評價該熒光定量PCR 的穩定性。

1.2.8 臨床樣品的檢測 將2018 年以來四川部分地區送檢的35 份疑似PRRSV 感染樣品，提取總RNA，制備cDNA，采用本研究建立的熒光定量方法進行檢測，同時用同樣的引物進行常規PCR 檢測。同時設置陰性對照和陽性對照，計算兩者陽性檢 出率。

2 結果

2.1 標準品的制備

以P1-F、P1-R 對重組質粒進行PCR 擴增，得到約131 bp 的克隆片段（圖1），測序結果正確并且未發生突變。經核酸蛋白檢測儀測定重組質粒的濃度，換算成拷貝數為2.25×1010copies/μL，作為熒光定量PCR 的標準品。

圖1 重組質粒的PCR 鑒定

2.2 熒光定量PCR反應條件的優化及標準曲線的繪制

經優化后確定了最佳反應體系和條件，反應體系為20 μL：2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μL：RNase-Free ddH2O 7μL，引 物P1-F 和P1-R 各1μL，模板1 μL。最佳反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸30 s，40 個循環；95℃終延伸10 s。以最佳反應體系和反應條件，取標準品的6 個稀釋度（2.25×107-2.25×102copies/μL）進行檢測，ABI 7500Softwarev2.0.1 分析軟件自動生成擴增動力學曲線（圖2-A）與標準曲線（圖2-B）。可見標準品濃度在2.25×107-2.25×102copies/μL 范圍內具有良好的線性關系，斜率為-3.304，截距為36.999，擴增效率R2為100.7%，即標準曲線y=-3.304x+36.999，其中x代表模板的起始拷貝濃度（copies/μL）的對數，y代表樣品擴增的Ct 值。

2.3 敏感性實驗

將陽性重組質粒從2.25×1010copies/μL 開始進行10 倍梯度稀釋，以每個稀釋度的質粒為模板，用本研究設計的特異性引物分別進行實時熒光PCR 和普通PCR。結果（圖3）顯示熒光PCR 的最大檢出量的稀釋度為101，且陰性對照未出現任何曲線；普通PCR 的最大檢出量的稀釋度為103，且陰性對照未出現條帶（圖4），表明該熒光PCR 的敏感性是普通PCR 的100 倍。

2.4 特異性實驗

圖2 不同稀釋梯度標準品擴增曲線（A）、熒光定量PCR標準曲線（B）

圖3 熒光定量PCR 的靈敏性實驗

圖4 普通PCR 的靈敏性實驗

以上述所提取的病毒的DNA 或cDNA 分別作為樣品模板，以引物P1-F 和P1-R 進行熒光定量PCR檢測，同時設立陰性對照，以最佳反應條件進行熒光定量PCR 檢測。結果（圖5）顯示，僅PRRSV NADC30-Like 檢測為陽性；其他病毒以及陰性對照未出現任何明顯的擴增曲線，檢測結果均為陰性。表明該方法具有良好的特異性。

圖5 熒光定量PCR 的特異性實驗

2.5 重復性實驗

取 釋 濃 度 為2.25×106、2.25×103、2.25×102copies/μL 的PRRSV NADC30-Like 的cDNA 作為模板，以最佳反應條件與體系進行熒光定量PCR 的批內與批間的重復性實驗。結果（表1）顯示，3 批4 次重復的批內重復性實驗變異系數（CV）分別為1.04%、0.38%、0.8%；4 次單獨批間重復性實驗變異系數（CV）分別為1.86%、0.91%、1.24%。批內與批間的變異系數（CV）均小于1.9%，表明該方法有良好的重復性。

2.6 臨床樣本的檢測

選取2018 年以來四川部分地區送檢的疑似存在PRRSV 感染病料，共計35 份，采用本研究建立的熒光定量方法進行檢測，同時進行常規PCR 檢測。最終以本研究建立的SYBR Green I qPCR 方法在35份病料樣本中檢出7 份陽性樣品，陽性檢出率為20%（7/35）；常規PCR 檢出4 份樣品，陽性檢出率為11.43%（4/35）。對本研究建立的SYBR Green I qPCR 檢測方法中多檢測出3 份陽性產物進行測序鑒定，NCBI blast 結果顯示均為PRRSV NADC30-Like毒株。綜上，本實驗建立的SYBR Green Ⅰ qPCR 方法具有更高的靈敏度與特異性，能較好的應用于臨床樣品的檢測。

表1 SYBRGreen Real-time qPCR 批內和批間重復性實驗結果

3 討論

PRRSV NADC30-like 毒株近幾年臨床檢出率逐漸增高，成為PRRSV 主要流行毒株，發病豬場母豬流產率高達40%左右，斷奶仔豬呼吸道癥狀嚴重，容易繼發鏈球菌、副豬嗜血桿菌、放線桿菌及巴氏桿菌等細菌感染，部分豬場死淘率高達20%以上，這給我國生豬產業帶來了新的挑戰［10-11］。NADC30-Like 與以往的毒株不同，該類病毒與其他PRRSV 重組機率顯著提升，重組后毒株之間毒力差異較大，導致現有的商品化疫苗不能對其提供有效的免疫保護［12］。PRRSV 疫苗毒株、田間野毒株分布廣泛，對于準確診斷加大不少難度，因此建立NADC30-Like 毒株高效、快速且準確的檢測方法對于防控PRRSV 就顯得十分必要，且在不使用探針的基礎上靈敏而快捷的優點使得該檢測方法更具廣闊的應用前景。

PRRSV Nsp2 基因具有高度的變異度，因此一直是PRRSV 用以基因分型鑒定的重要基因之一。NADC30-Like 毒株Nsp2 基因基于VR-2332 毒株株序列在aa 323-433、aa 481、aa 533-551 存在“111+1+19”aa 氨基酸不連續缺失的特點［13］，這在PRRSV 基因分類使用時極為保守，針對此特點設計特異性引物。通過對反應體系與反應條件的優化，確定了最佳反應體系與反應條件，從而建立了PRRSV NADC30-Like 熒光定量PCR 檢測方法。在特異性實驗時，利用此方法對本實驗室分離保存的NADC30-Like 毒株進行檢測，結果為陽性；同時對8 種常見感染豬的病毒進行檢測，結果無任何明顯非特異性擴增，表明此方法具有較好的特異性，有利于NADC30-Like 的專一性檢測。本實驗建立的熒光定量PCR 在標準品拷貝數為2.25×107-2.25×102copies/μL 范圍內具有良好的線性關系，y=-3.304x+36.999，其擴增效率R2為100.7%，可通過此關系（方程式）來準確計算出樣品的拷貝數（即濃度）或者Ct 值，此方法簡便快速，且十分精確。在靈敏度實驗中此熒光PCR 最低可檢測到2.25×101copies/μL 的標準陽性質粒，而普通PCR 只能檢測到2.25×103copies/μL 的標準品，熒光定量的靈敏性比普通PCR 高約100 倍，由此可見其具有高度的靈敏性，對低含量的NADC30-Like 也十分有效。批內與批間的變異系數均小于1.9%，表明其具有高度的重復性，在不同的外界條件下，其檢測結果基本一致，增加了此檢測NADC30-Like熒光PCR技術的可靠性。在臨床樣品的檢測中，用熒光定量PCR 對35 份疑似PRRSV 感染樣品進行檢測，結果7 份樣品與陽性對照檢測為NADC30-Like 陽性，而普通PCR 只檢測出3 份陽性樣品，這也證實了該建立的熒光PCR 方法的靈敏性高于普通PCR，表明該方法可直接用于臨床樣品中PRRSV NADC30-Like 的快速檢測，實現定量檢測，操作簡便，對疾病的診斷、開展流行病學調查與疫苗研發等方面具有重大意義。

4 結論

本研究根據PRRSV NADC30 毒株Nsp2 基因保守序列設計特異性引物，通過優化確定最佳反應條件，并進行靈敏度、特異性、重復性實驗以及臨床樣品的檢測，建立了PRRSV NADC30-Like 毒株熒光定量PCR 檢測方法，標準品在107copies/μL 到102copies/μL 濃度范圍內具有良好的線性關系，最低可檢測到2.25×101copies/μL 的標準品陽性質粒；該方 法 與HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV 無交叉反應，批內和批間的變異系數（CV）小于1.9%，在臨床樣品的檢測中較普通PCR有更高的檢出率。該方法具有敏感性高、特異性強、穩定性好、準確度高和檢測快速等優點，可用于PRRSV NADC30-Like 感染的早期診斷、樣品的快速檢測與定量分析。