基于數字PCR 的不同品種鴨組織中線粒體與核DNA拷貝數差異研究

紀藝 徐曉麗 姜媛媛 汪小福 徐俊鋒 李玥瑩 陳笑蕓

（1. 沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034；2. 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所 省部共建農產品質量安全國家重點實驗室， 杭州 310021）

食品安全關乎人們的身體健康和生命安全，已經成為當前全社會關注的熱點問題。近年來肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好，引起人們對食品安全的高度關注［1］。肉及肉制品動物源性成分核酸檢測是判斷摻假肉的最常用技術之一［2］。與核DNA相比，線粒體DNA 具有其特殊的母系遺傳方式和胞內多拷貝帶來的高靈敏度檢測的特征，因此，除被廣泛用于飼料、生鮮及肉制品的來源追蹤和物種成分鑒別等研究外，線粒體DNA 在國內外還被用于摻假肉類的定量檢測［3-7］。

鴨肉是我國較為便宜的畜牧業肉類品種，也是最常見的被用于摻假的肉品。近年來，在國內外PCR 技術在肉類摻假以及肉類品種來源分析中以及得到廣泛應用［8-9］。林霖等［10］構建了實時熒光PCR檢測方法用于檢測番鴨、家鴨DNA 成分，為識別摻假肉類提供了技術支持。但是，熒光定量PCR 需要依賴標準曲線，由于不同組織中線粒體的拷貝數不同［11-12］，使得基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測存在客觀的技術局限性。微滴式數字PCR 可以通過對樣品進行微滴化處理，對每個微滴逐個進行檢測，從而實現絕對定量。

本研究通過數字PCR 技術測定不同品種鴨不同組織中線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數，對線粒體和核DNA 的拷貝數比值進行分析，旨在探尋鴨肉制品摻假定量檢測的最佳組織來源，并為檢測機構定量鴨肉摻假比例篩選合適的靶DNA 提供一定的 借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

不同品種（紹興鴨、北京鴨、縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨、金定麻鴨、山麻鴨、GD-紹興鴨和馬太湖鴨）的生鮮鴨來源于浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所和中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，其中北京鴨和紹興鴨的取樣組織包括鴨血、鴨胸、鴨肝、鴨皮、鴨心及鴨腿；縉云麻鴨、攸縣麻鴨、高郵麻鴨和GD-紹興鴨的取樣組織包括鴨胸和鴨腿；山麻鴨、金定麻鴨、攸縣鴨和馬太湖鴨的取樣組織為鴨血。

動物組織DNA 試劑盒購自杭州新景生物試劑開發有限公司；血液DNA 提取試劑盒購自浙江易思得生物科技有限公司；預混液ddPCR Supermix for Probes 和Droplet Generation Oil for Probes 購 自 美 國Bio-Rad；引物和探針由杭州尚亞賽生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理和DNA 提取 用無菌手術刀將試驗材料切成小塊，先在液氮中將樣品迅速冷凍并研磨成粉末。按照試劑盒說明書的要求稱取一定量的樣品，采用相應的試劑盒對所有樣品進行 DNA 提取，每個樣品設置3 個平行重復。

1.2.2 DNA 濃度、純度和鹽殘留測定 各取1 μL 的DNA 樣品溶液用Qubit 2.0 進行DNA 的濃度檢測，利用NanoDrop 2000 進行純度和鹽殘留等指標的 檢測。

1.2.3 鴨源性微滴式數字PCR 檢測體系的建立 鴨線粒體基因和核單拷貝基因的PCR 引物和探針序列參考文獻合成［13］，線粒體12S rRNA 基因的上游引物序列為5′-GATCAAAATGCAACTAAGCTGTCGC-3′；下游引物序列為5′-GACCTGTCTTATTAGCGGGGTGCTG-3′；探針序列為FAM-CCCTAAATCTTGATACTTACCCTACCGAA-BHQ1；IL-2 核基因的上游序列為5′-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3′，下 游 序列 為5′-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3′，探針序列為FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1。將上述提取的不同鴨組織DNA 稀釋至同一濃度后作為模板，進行微滴式數字PCR 反應。PCR 體系為20 μL，含前述步驟所得的DNA 模板2 μL，2×ddPCR Supermix for Probes 反應液10 μL，10 μmol/L 的上下游引物各1 μL，10 μmol/L 的探針0.5 μL，其余用ddH2O 補足到20 μL。

PCR 反應程序中退火溫度的高低對微滴下雨現象有顯著的影響，在反應程序的退火環節，設置了溫度梯度。根據PCR 反應的熱圖，鴨源性基因組DNA 在不同的退火溫度下，微滴的熒光強度存在較顯著差異（圖1）。比較不同退火溫度的數字PCR 擴增熱圖，發現在退火溫度為60℃時，沒有明顯的下雨現象，確定數字PCR 的最佳退火溫度60℃。最終，確定微滴式數字PCR 反應程序如下：95℃預變性10 min；40 個循環（94℃ 變性15 s，60℃退火延伸1 min）；98℃變性10 min；4℃保存。

圖1 微滴式數字PCR 退火溫度優化擴增熱圖

1.2.4 DNA 拷貝數定量分析 微滴式數字PCR 結束后，將96 孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，使用軟件QuantaSoft Version 1.6.6.0320 分析實驗數據，獲得DNA 模板拷貝數的絕對定量結果。

2 結果

2.1 DNA質量測定

采用熒光計Qubit 2.0 測定DNA 濃度，利用NanoDrop 2000 核酸蛋白測定儀來測定DNA 純度和鹽殘留情況，提取DNA 的濃度及純度等參數見表1。結果顯示，提取的DNA 濃度在20 ng/μL-200 ng/μL 之間，說明在不同組織中都能提取到較理想的DNA；OD260/OD280比值基本都在1.8-2.0 之間，說明蛋白質和RNA 等雜質殘留少；OD260/OD230比值普遍大于2.0，說明核酸中鹽分等雜質殘留少，提取的DNA 質量較好。鑒于所提取組織的DNA 濃度不同，因此將工作濃度統一調整為8.89 ng/μL，并用于后續實驗。

2.2 鴨源性微滴式數字PCR檢測體系的建立

微滴式數字PCR 可實現對基因拷貝數的絕對定量，如在反應體系中加入GD-紹興鴨胸和馬太湖麻鴨血的DNA，利用微滴式數字PCR 分別讀取IL-2核基因和12S rRNA 線粒體基因的拷貝數。從圖2 可知，灰色為陰性微滴，藍色為陽性微滴，在FAM 熒光通道上均擴增出鴨源性的信號，且得到良好的擴增，滿足分析要求。從實驗結果來看，不同鴨品種間的DNA 其IL-2 核基因的拷貝數較為穩定，而12S rRNA 線粒體基因的拷貝數變化較大，表明線粒體的豐度存在較大差異。

2.3 DNA拷貝數分析

結果如表2 所示，微滴式數字PCR 反應測得8.89 ng/μL 的DNA 中含有的核DNA 拷貝數平均值為13 470，與理論值［14］接近，所有組織中核DNA 拷貝數的變異系數為11.16%，小于線粒體DNA 拷貝數的變異系數（26.23%），表明核DNA 是開展鴨肉制品摻假定量檢測的最適DNA 來源。線粒體DNA的拷貝數在不同鴨品種乃至同一品種不同組織間存在較大差異。整體而言，鴨肝中線粒體拷貝數最高；鴨心、鴨胸肉、鴨腿肉和鴨皮中的線粒體拷貝數次之；鴨血中的線粒體拷貝數最低。

表1 不同品種鴨組織DNA 的提取質量

2.4 線粒體和核DNA拷貝數穩定性分析

線粒體DNA 的拷貝數和核DNA 拷貝數的比值能反映提取DNA 中線粒體的相對豐度。如表2 所示，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數比值最高；鴨心及鴨胸/腿肉中的拷貝數比值次之；鴨皮的拷貝數比值再次之；鴨血的拷貝數比值最低。分析6 個不同組織中線粒體/核DNA 拷貝數比值后可知，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數比值的變異系數最大；鴨血和鴨心次之；而鴨腿肉的變異系數最小（4.10%）。

圖2 微滴式數字PCR 檢測不同品種鴨組織DNA 核和線粒體DNA 的拷貝數

3 討論

以DNA 為基礎的PCR 技術被廣泛用于食品中動物源性成分的鑒別，目前國內外學者常利用線粒體基因來開展肉類摻假的定性和定量檢測［15-18］。眾所周知，線粒體是產生ATP 的細胞器，在能量代謝旺盛的細胞中，線粒體的數量相對豐富［19］。然而，由于不同組織的能量代謝水平不同，其線粒體的豐度也不盡相同，這勢必影響基于線粒體DNA 的肉類摻假定量檢測的準確性。本研究提取了9 個鴨品種不同組織的總DNA，并測定了線粒體DNA 和核DNA 的拷貝數及其比例情況。

從檢測結果可知，不同品種鴨源性核DNA 的拷貝數穩定性好，而線粒體DNA 拷貝數在不同組織中存在較大的差異，核DNA 是開展鴨肉摻假定量檢測的最優選擇。在檢測的6 個組織中，鴨肝中線粒體/核DNA 拷貝數比值及其最大，這與肝臟是重要的代謝器官密切相關［20］；鴨胸肉、鴨心、鴨腿肉和鴨皮次之，這與心肌細胞參與心臟舒縮活動和骨骼肌參與機體運動密不可分［21］；鴨血中拷貝數比值最低，說明在開展基于線粒體DNA 的摻假比例定量檢測時須充分考慮摻假物的組織來源，以免影響檢測的準確性。本研究發現鴨腿肉的變異系數最小，這可能與腿部骨骼肌在鴨子日常運動中發揮動力作用緊密相關［22］。因此，在開展基于核DNA 的鴨肉摻假比例定量檢測時，不同品種以及組織均可進行測定；線粒體DNA 作為靶基因的鴨肉摻假比例定量檢測時，鴨腿肉來源的肉制品是最佳選擇。本文為鴨肉制品甚至其他肉制品開展摻假定量檢測選擇合適的靶DNA 提供參考。

表2 不同品種鴨組織中線粒體和核DNA 拷貝數及拷貝數比值情況

4 結論

核DNA 的拷貝數在不同品種鴨組織中具有良好的穩定性，是開展鴨肉制品摻假定量檢測的最適DNA 來源。在開展利用線粒體DNA 為參比的摻假定量檢測時，需充分考慮不同組織中線粒體的豐度問題，以免影響檢測的準確性。不同品種鴨腿肉中線粒體/核DNA 拷貝數比值的變異系數最小。

致謝：

感謝浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所和中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供實驗材料。