巴西橡膠樹HbAIH 基因的克隆及表達分析

楊洪 岳鎰繁，2 胡燕玲，2 鄧治 代龍軍 李德軍

（1. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所 農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海口 571101；2. 南京農業大學農學院，南京 210095）

多胺（Polyamines，PAs）是一類廣泛存在于生物體內的具有較強生物活性的小分子脂肪族含氮堿，常見的多胺種類有腐胺（Putrescine，Put）、亞精 胺（Spermidine，Spd）、 精 胺（Spermine，Spm）和尸胺（Cadaverine，Cad）等。此外，高亞精胺（Homospermidine，Hspd）、高精胺（Homospermine，Hspm）、降亞精胺（Norspermidine，Nspd）和降精胺（Norspermine，Nspm）等稀有多胺也陸續被發現。已有許多研究表明，多胺在植物正常生長、發育、逆境應答等眾多生理過程中發揮重要作用［1-6］。在生理pH 環境下，多胺極易與核酸和酸性蛋白質相結合，參與轉錄、翻譯和物質的跨膜轉運過程的調控［4，7-10］。多胺的積累往往與植物抵抗逆境的能力成正相關。逆境脅迫下，植物多胺的含量和多胺合成酶的活性顯著上升，抗逆性增強。因此，在農業生產中常通過外源施加多胺來提高植物對干旱、高鹽、低溫等逆境的抵抗能力［11-13］。此外，多胺在植物體內還起著類似于cAMP“第二信使”的作用，通過與NO、γ-氨基丁酸、脯氨酸和植物激素等物質相互作用來促進植物生長、發育，增強逆境適應 能力［14-16］。

在生物體內，多胺的合成起始于腐胺的生物合成，因此腐胺的合成對生物體內源多胺的合成至關重要。根據合成起始物的不同，腐胺的生物合成途徑分為鳥氨酸途徑和精氨酸途徑［17］。鳥氨酸途徑是一個單反應過程，前體鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）的作用下脫羧直接生成腐胺；精氨酸途徑則以精氨酸為前體在精氨酸脫羧酶（Arginine decarboxylase，ADC）的作用下脫羧生成鯡精胺（Agmatine，AGM），AGM 相繼經鯡精胺亞胺水解酶（Agmatine iminohydrolase，AIH）和N-氨甲酰腐胺-酰胺水解酶（N-carbamoylputrescine amidohydrolase，CPA）作用最終生成Put。已發現有些植物（如擬南芥、小立碗蘚）由于ODC 基因的缺失使得精氨酸途徑成為其腐胺合成的唯一途徑［18］。作為精氨酸途徑中3 個酶之一，AIH 基因或蛋白已在玉米、小麥、大豆和擬南芥等植物中克隆或純化，關于該酶結構特征的研究也部分報道［19-22］。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）屬于大戟科喬木，是目前唯一大面積商業化種植用于生產天然橡膠的產膠植物。在生產中，通過割膠切斷樹皮中次生乳管從而使膠乳流出獲得天然橡膠的原始材料。巴西橡膠樹膠乳中主要含有Put、Spd 和Spm 三種多胺，且以Put 為主；割面上的Put 和PAs 總含量高于非割面，割面上離割口越近Put 含量越高，其生物合成越活躍，而非割面上的Put 及其它多胺垂直變化不大［23］。這些結果說明Put 可能是橡膠樹膠乳中的重要多胺，對調節橡膠樹橡膠生物合成和膠乳再生具有重要作用。巴西橡膠樹中多個多胺合成途徑基因已相繼報道，但對AIH 基因了解甚少［24-25］。本研究克隆了巴西橡膠樹AIH 基因并對其進行生物信息學及表達特性分析，旨在為進一步豐富和完善多胺在巴西橡膠樹中的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本文試驗材料為巴西橡膠樹品系熱研-73397，葉、莖尖、雄花、雌花、健康及死皮橡膠樹膠乳和樹皮等組織樣品均采自中國熱帶農業科學院試驗農場開割橡膠樹，葉片不同發育階段樣品采自國家橡膠樹種質資源圃。每樣品取3 個生物學重復，每重復選3株橡膠樹。樣品采集后用液氮速凍，-80℃保存。

低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫處理材料為移栽培養6 個月的熱研-73397 組培苗。低溫處理在4℃人工氣候箱中進行；干旱和高鹽脅迫處理參照劉輝等［26］方法，分別用30% PEG 6000 和1 mol/L NaCl 溶液模擬干旱和高鹽環境。各處理于設定時間點采集第2 和3 片葉，以未處理正常植株作對照。以上各處理每時間點均設3 次生物學重復，每重復5 株組培苗。樣品采集后液氮速凍，-80℃保存，用于RNA 提取。

過氧化氫（H2O2）、乙烯利和茉莉酸甲酯（MeJA）等處理材料為達到開割標準的未開割橡膠樹品系熱研-73397。H2O2處理分別參照Tang 等［27］和Zhu 等［28］方法，乙烯利和MeJA 處理參照Hao 等［29］方法，以不作任何處理的未開割樹為對照。每處理每時間點均設3 個生物學重復，每重復5 棵樹。各處理于設定時間點采集膠乳，液氮凍存，用于RNA 提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取及cDNA 合成 使用植物通用總RNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）說明書提取橡膠樹RNA，采用DNase I（Fermentas）去除RNA 中的DNA。利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa）反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2HbAIH的 克 隆 3′-RACE（rapid amplification of cDNA ends）采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）試劑盒進行。3′-RACE所用引物為5′- CACCAAACACAAGACTTGCTG-3′和5′-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3′。按照試劑盒說明用3′-RACE CDS Primer A 對1 μg 各組織混合RNA進行反轉錄，以獲得的cDNA 為模板用PrimeSTAR Max Premix（TaKaRa，Dalian，China）進行3′端序列的擴增。將獲得的3′端序列與轉錄組中獲得的unigene 序列進行拼接，并設計全長cDNA 擴增引物，進行PCR 擴增驗證。

1.2.3HbAIH生物信息學分析 利用ORF finder 預測開放閱讀框；用在線程序Smart（http：//smart.emblheidelb erg.de/） 和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對蛋白保守結構域進行分析；用Expasy 網 站 的ProtParam 程 序（http：//web.expasy.or g/protparam/）分析蛋白質分子量、等電點、氨基酸組成等理化性質；用NCBI 中的BLAST和DNASTAR 軟件進行同源性分析；信號肽預測用SignalP 4.1 Server 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），采用程序TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk- /services/ TMHMM/）預測跨膜結構域。用ClustalX 和MEGA6.0 進行多序列比對和Neighbor-Joining 進化樹的構建，多序列比對顯色用ESPript 工具完成［30］。

1.2.4 實時熒光定量PCR 分析 根據測序結果設計HbAIH基因實時熒光定量PCR 引物，正、反向引物序列分別為5′-CCAAATCATGAGGTGGTGAG-3′和5′-GCTCTAGACCAAGCTACTAG-3′。 選 擇 巴 西橡膠樹HbUBC4作為內參基因，正、反向引物序列 分 別 為5′- TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′ 和5′- TTTCTTTGGTGACGCTGCAA-3′。 根 據SYBR Green I Master Mix 試劑盒說明書qPCR 反應體系如下：SYBR? Premix Ex TaqTM（2×）（TaKaRa）10 μL，正、反向引物各1 μL，模板 2 μL，補ddH2O 至20 μL。每樣品設置3 次重復。qPCR 在Bio-Rad CFX96 qPCR 儀進行，程序設置為：95℃預變性5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，40 個循環后進行熔解曲線分析，以確定引物的特異性。基因相對表達量采用公式2-ΔΔCt計算。

2 結果

2.1 HbAIH的克隆及序列特征

通過對巴西橡膠樹轉錄組測序結果分析，獲得了一條與植物AIH 基因序列高度同源的unigenes。利用RT-PCR 和3′-RACE 技術獲得了該序列完整開放閱讀框（ORF，open reading frame）和全部3′端序列（圖1）。序列分析結果表明，擴增獲得的基因全長1 462 bp，ORF 長為1 137 bp，編碼378 個氨基酸。同源序列比對結果表明，該蛋白與木薯、蓖麻、麻風樹、毛果楊等AIH 蛋白序列一致性較高，故將該基因命名為HbAIH。

預測HbAIH 分子量為42.28 kD，理論等電點為5.09。不穩定系數為39.09，為穩定蛋白。信號肽預測結果表明，HbAIH 不含有信號肽，為胞內蛋白。疏水性分析表明，該蛋白親水性氨基酸為152 個，占40.21%；疏水性氨基酸為167 個，占44.18%，平均疏水系數為-0.411，為親水性蛋白。氨基酸組成中帶有負電荷的氨基酸（Asp+Glu）共有51 個，占13.49%；帶有正電荷的氨基酸（Arg+Lys）共有35 個，占9.26%。跨膜結構域預測結果表明，HbAIH 不含跨膜結構域，為非膜蛋白。

2.2 HbAIH基因結構分析

將HbAIHcDNA 序列在橡膠樹熱研-73397 基因組數據中進行比對，獲得HbAIH基因組序列，序列全長8 446 bp。編碼區含有10 個外顯子和9 個內含子（圖2），外顯子長度介于56-233 bp，內含子長度介于95-1 799 bp 之間。所有內含子的剪切位點均符合真核生物“GT-AG”規則。利用GSDS 2.0 在線工具分析了橡膠樹、木薯、麻風樹、蓖麻、可可、擬南芥和玉米等的AIH 基因結構，結果表明這些植物AIH具有相同的外顯子/內含子組織形式，都由10 個外顯子和9 個內含子組成（圖2）。

2.3 HbAIH同源比對及二級結構特征

圖1 HbAIH cDNA 序列及其推導的氨基酸序列

將HbAIH 與其它物種AIH 基因的氨基酸序列進行同源序列比對，結果（圖3）表明HbAIH 與木薯MeAIH 氨基酸序列一致性最高，達90.74%。其次是大戟科的蓖麻RcAIH 和麻風樹JcAIH，一致性分別是87.57%和85.57%。與原核生物糞鏈球菌EfAIH 和變形鏈球菌SmAIH 氨基酸序列一致性最低，分別為43.57%和45.34%。利用在線程序SOPMA 對HbAIH 進行二級結構預測。結果表明HbAIH 二級結構以無規則卷曲為主要構成元件，占42.86%；其次是α-螺旋和被β 片層結構，占比例分別為26.19%和22.75%；β-轉角結構最少，僅占8%。

2.4 HbAIH系統進化分析

在橡膠樹與與其他物種AIH 氨基酸同源比對分析的基礎上，利用NJ 法進行了分子進化樹聚類分析。如圖4 所示，巴西橡膠樹HbAIH 與木薯MeAIH、麻風樹JcAIH 位于同一進化分枝，親緣關系最近，而其它植物AIHs 親緣關系較遠；細菌AIHs 單獨聚類為一大枝。

圖2 HbAIH 及其他植物AIH 基因結構示意圖

2.5 HbAIH組織表達特性及對橡膠樹死皮的響應

組織表達譜分析結果表明，HbAIH在巴西橡膠樹莖尖、膠乳、葉、樹皮、雌花、雄花等各組織中均有表達，其中，在雌花中表達量最高，雄花中表達量最低（圖5-A）。比較健康和死皮橡膠樹中表達差異發現，HbAIH基因在膠乳中的表達量高于樹皮，且在死皮橡膠樹膠乳和樹皮中的表達量均高于健康樹（圖5-B）。在葉片不同發育階段，HbAIH基因的表達也存在差異，其中，在淡綠期表達量最高，接下來依次是變色期、衰老期、古銅期，穩定期表達量最低（圖5-C）。

2.6 HbAIH響應逆境脅迫及激素處理的表達模式

膠乳中HbAIH表達受H2O2、乙烯利和MeJA 調控。H2O2處理抑制HbAIH表達，處理6 hHbAIH表達水平顯著低于處理前，24 h 達到最低，48 h 略有升高但仍低于處理前水平（圖6-A）。乙烯利處理前8 h，HbAIH表達水平持續下降，處理24、48 和72 h該基因表達水平基本一致但仍低于處理前（圖6-B）。MeJA 處理下，膠乳中HbAIH的表達呈下降-上升-下降波浪式變化，處理4 h 該基因表達量最低，24 h該基因的相對表達量達到最高（為處理前1.5 倍），此后該基因的表達量開始下降，至48 h 恢復到處理前水平（圖6-C）。

圖3 HbAIH 與其它AIH 多序列比對及二級結構預測

圖4 HbAIH 與其它物種AIHs 蛋白序列聚類分析

圖5 HbAIH 在巴西橡膠樹不同組織（A）、健康及死皮橡膠樹膠乳和樹皮（B）及葉片不同發育時期（C）表達模式

葉片中HbAIH的表達也受低溫、干旱和高鹽的影響。低溫脅迫下，HbAIH的表達呈現出波浪形變化，處理3 h 該基因相對表達量降低，然后開始升高，處理24 h 該基因相對表達量達到最高值，為處理前的1.4 倍，然后又開始下降，處理48 h 基本恢復處理前水平（圖6-D）。PEG 模擬干旱脅迫3 h，葉片中HbAIH表達量高于處理前，為處理前的1.3 倍；此后，該基因表達開始下降，處理48 h 恢復處理前水平（圖6-E）。高鹽脅迫3 h，葉片中HbAIH表達基本沒有變化；隨后，HbAIH的表達快速升高，脅迫48 h 時該基因的表達量達到最高，為處理前的3倍（圖6-F）。

3 討論

圖6 不同處理條件下HbAIH 的表達模式

真核生物中僅植物能夠通過精氨酸途徑合成腐胺，AIH 是該途徑中的第二個酶。根據結構分類，AIH 屬于戊烷超家族中的卟啉單胞菌型肽基精氨酸脫氨酶家族成員，具有該家族特有的以5 個αββαβ重復單元組成的螺旋槳式結構特征［31-32］。研究表明，AIH 是一個同源二聚體蛋白，且參與2 個亞基間氫鍵形成的氨基酸高度保守［20，22，33］。本研究克隆獲得了巴西橡膠樹AIH 基因HbAIH，該基因序列全長1 462 bp，ORF 序列長1 137 bp，編碼378 個氨基酸。生物信息學分析表明，HbAIH 為親水性蛋白，不含跨膜結構域和信號肽。蛋白序列比對分析結果表明，酶活性位點形成和參與底物結合的11 個氨基酸在HbAIH 及其他植物AIH 氨基酸高度保守。氨基酸相似性分析及系統進化分析結果表明HbAIH 與大戟科木薯MeAIH 和麻風樹JcAIH 等的相似性最高，預示著它們親緣關系較近，這與植物學傳統分類一致。

組織表達譜表明HbAIH表達無組織特異性，在本研究所檢測的橡膠樹6 個組織中均有表達但表達量具有差異。HbAIH在雌花中表達量最高而在雄花中表達量最低，推測HbAIH可能與橡膠樹雌花發育有關。此外，不同發育階段葉片中HbAIH的表達也存在一定差異。死皮和健康橡膠樹膠乳和樹皮表達結果表明，HbAIH在死皮橡膠樹膠乳和樹皮中表達均有上調。橡膠樹死皮是割面部分或全部不排膠的現象，這暗示HbAIH可能參與橡膠樹死皮發生和膠乳再生的分子調控過程。乙烯利（Ethephon，ET）在天然橡膠生產中常用于刺激膠乳合成和排膠，具有明顯的增產效果［34］；茉莉酸是乳管分化和發育的重要調節因子，可以誘導橡膠樹乳管分化，調節橡膠生物合成［29，35-36］。本研究發現，乙烯利和茉莉酸甲酯處理后HbAIH表達存在波動，但整體呈下調趨勢，暗示其可能負向調控橡膠樹ET 反應和產排膠過程。

我國屬于非傳統植膠區，橡膠樹生長周期內經常遭受季節性干旱、低溫、臺風等逆境的影響，這些逆境因子嚴重制約著巴西橡膠樹的膠乳產量和質量。本研究發現低溫、干旱、高鹽等逆境脅迫下，HbAIH的表達有不同程度上調，表明該基因可能參與了巴西橡膠樹逆境響應過程。過氧化氫誘導的氧化脅迫下，HbAIH的表達明顯下調，表明該基因可能負向調控巴西橡膠樹氧化脅迫應答。

4 結論

從巴西橡膠樹中克隆獲得HbAIH，其開放閱讀框1 137bp，編碼378 個氨基酸，預測其是一個親水性蛋白。HbAIH表達無組織特異性，在檢測的組織中均有表達。HbAIH可能參與巴西橡膠樹葉片生長發育、逆境應答等過程，并可能參與橡膠樹死皮發生和膠乳再生的調控。