苦參種子深加工過程油脂類副產物發酵產靈菌紅素的 研究

倪亮 張森 郭盛 曾飛 徐明明 段金廒

（1. 南京中醫藥大學 江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心 國家中醫藥管理局中藥資源循環利用重點研究室，南京 210023；2. 南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029）

靈菌紅素（Prodigiosin）是由粘質沙雷氏菌、放線菌及海洋細菌等微生物產生的一種具有3 個吡咯環骨架結構的生物堿類天然紅色素［1-4］，具有抑菌、免疫抑制、抗腫瘤、抗瘧疾等廣泛的生理活性［5-7］，現已成為抗腫瘤藥物研發的重要前體物質，相關藥物研究已進入FDA 臨床II 期［8］。靈菌紅素也廣泛應用于傳統染織品，具有良好的上染度和色牢度，染色織物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有的較高的抑菌率［9-12］。近年來，采用微生物發酵法生產靈菌紅素已成為國內外研究的熱點［13-14］。在研究過程中，研究人員發現以植物油脂為碳源，可以顯著提高靈菌紅素的產量，如Giri 等［15］以花生粉的油脂加入培養基時，粘質沙雷氏菌產靈菌紅素的產率有較顯著提高。

中藥資源產業化過程中產生的非藥用部位及廢棄藥渣依然含有大量值得開發的資源性物質，任由其丟棄不僅浪費資源，且會導致一系列環境污染等問題。本課題組前期研究顯示，在苦參藥材生產過程中產生的大量苦參種子資源可作為提取苦參堿類生物堿資源性物質的重要原料，并建立了其提取純化工藝［16］。但是提取完生物堿類成分的藥渣等固廢物因缺乏有效利用途徑而廢棄，造成資源浪費與環境污染［17］。對該類固廢物進一步研究顯示，其含有較高比例的脂肪油，是具有一定開發潛力的油脂原料。據此，本研究以提取生物堿類成分后所產生的苦參種子固廢物油脂為原料，進行發酵生產靈菌紅素工藝研究，以期為苦參種子固廢物的資源化利用提供科學依據，為苦參資源產業的提質增效提供 支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

篩選培養基（（NH4）2SO40.03 g/L、尿素0.3 g/L、KH2PO40.2 g/L、苦參種子油5 g/L、MgSO40.1 g/L）、種子培養基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L）、酵母膏蔗糖培養基（酵母膏5 g/L，蔗糖5g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 10 g/L） 均 為 自 制， 其 中 （NH4）2SO4、尿素、KH2PO4、MgSO4以及NaCl 購自國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏、牛肉膏購自南京良緯生物科技有限公司。

苦參種子藥渣為采用酸水提取工藝提取生物堿后所得，經烘干、粉碎、過60 目篩后，自然壓榨法制得種子油。樣品置于4℃冰箱保存備用。花生油、橄欖油為市售自然壓榨商品，樣品置于4℃冰箱保存備用。

Waters ACQUITY UPLC 系統（包括四元泵溶劑系統、在線脫氣機和自動進樣器，美國Waters 公司）；Waters Q-TOF Premier 飛行時間質譜儀（美國Waters 公司）；BT125 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；Milli-Q Advantage 超純水系統（美國Millipore 公司）；KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Beckman Coulter Microfuge 16型離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。乙腈為色譜純，購自德國默克公司；其他化學試劑均為分析純，購自上海國藥化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選與鑒定

1.2.1.1 菌株篩選 采集自江蘇南京某化工廠周邊土壤，經過200 目過篩，稱取1 g 土樣于100 mL滅菌水中，37℃、120 r/min 震蕩6 h。混合菌液在以苦參種子油為唯一碳源的選擇培養基上進行富集，37℃、培養48 h。吸取1 mL 梯度稀釋100 倍、 1 000倍、10 000倍涂布平板后，37℃條件下培養28 h，挑選紅色單菌落于LB 平板上劃線分離純化，獲得單菌落，同時對純化后的菌株進行液體發酵復篩。

1.2.1.2 菌株的鑒定 對復篩后的菌株，進行形態學觀察，同時進行16S rDNA 鑒定，測序結果在NCBI 中進行對比，并利用MEGA7.0 軟件繪制出該菌株的系統發育樹。

1.2.2 斜面培養 將菌株劃線接種于LB 斜面，30℃培養48 h。種子培養：每支斜面加5 mL 無菌水，取1 mL 接入種子培養基中，轉速180 r/min，30℃條件下培養24 h。發酵培養：500 mL 三角瓶中裝入發酵培養基150 mL，按3%接種量接入種子培養液，轉速180 r/min 搖床培養。

1.2.3 發酵產物靈菌紅素的分析 供試品溶液的制備：精密量取發酵液1 mL 12 000 r/min 離心分別收集沉淀和上清液。將沉淀和發酵液上清液分別精密加入10 mL 和9 mL 酸性甲醇（pH 2-3），震蕩混勻，靜置至沉淀基本無色，4 500 r/min 離心5 min，合并提取液靜置30 min，經0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

UPLC 色譜條件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫：0-12 min，5%-100% B；12-13 min，100%-100% B；13-20 min，100%-5% B。流速0.4 mL/min；柱溫30℃；進樣體積 2 μL。檢測波長：535 nm。

Q-TOF-MS/MS 質譜條件：ESI+離子化模式；毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣溫度550℃，脫溶劑氣流量1 000 L/h，錐孔氣流量50 L/h，碰撞氣流量0.15 mL/min。

標準曲線的繪制：精密稱取對照品靈菌紅素，制成一定濃度的對照品儲備液。甲醇稀釋成不同濃度的對照品溶液（0.005-0.16 mg/mL），以峰面積為縱坐標Y，對照品溶液濃度為橫坐標X，進行線性回歸分析，繪制靈菌紅素標準曲線。

1.2.4 菌體干重的測定 將粘質沙雷氏菌L9 接種于LB 平板，培養24 h 活化。取活化單菌落接種于LB 液體培養基，30℃恒溫，180 r/min 搖瓶培養24 h。分別取發酵液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL 至10 mL 已知重量的不同離心管中，用于檢測吸光度以及菌體干重。用甲醇稀釋至10 mL，離心，純水重懸并再次離心，重復兩次，收集沉淀。濕菌體于60℃烘干至恒重，得菌體干重（Dry cell weight，DCW）。將發酵液按照上述步驟離心收集沉淀，純水稀釋在λ600nm處測試吸光度。

1.2.5 粘質沙雷氏菌L9 發酵條件優化

1.2.5.1 發酵時間對菌體生長與靈菌紅素產率的影響 考察發酵時間對靈菌紅素產率的影響，取50 mL 酵母膏蔗糖培養基裝入250 mL 錐形瓶中平行三批次，加入已活化24 h 種子液1 mL，以未接種的空白培養基做等量稀釋作對照，30℃、180 r/min 培養50 h，每隔4 h 測定其靈菌紅素產量，以發酵時間為橫坐標，靈菌紅素產量和菌體干重為縱坐標繪制曲線圖。

1.2.5.2 不同碳源對靈菌紅素產率的影響 在酵母膏蔗糖培養基基礎上分別選取葡萄糖、甘油、苦參種子油、花生油、橄欖油及可溶性淀粉替代蔗糖作為粘質沙雷氏菌L9 發酵培養基的碳源，每種碳源添加5 g/L、10 g/L 的濃度，平行三批次對碳源進行篩選，測量各發酵液的靈菌紅素含量。

1.2.5.3 不同氮源對靈菌紅素產率的影響 在已優化的單因素基礎上，分別選取牛肉膏、酵母膏、尿素及硫酸銨作為粘質沙雷氏菌L9 發酵培養基的氮源，每種氮源添加5 g/L、10 g/L 的濃度，平行三批次對氮源進行篩選，測量各發酵液的靈菌紅素含量。

1.2.5.4 不同發酵溫度對靈菌紅素產率的影響 在已優化的單因素基礎上，選取28℃、30℃、32℃、34℃及37℃為L9 菌株的發酵溫度，測量靈菌紅素的產量和菌體干重。

1.2.5.5 金屬離子對對靈菌紅素產率的影響 在已優化的單因素基礎上，分別選擇Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+及Zn2+作為考察因素，測量不同濃度金屬離子對于靈菌紅素產量的影響。

2 結果

2.1 菌株篩選及鑒定

從江蘇南京某化工廠周邊土壤中篩選得到5 株能以苦參種子油為唯一碳源生長的菌株，其中1 株（L9）長勢最佳，挑選該菌株開展后續研究。

將L9 菌株接種于LB 培養基上30℃培養2 d，其在培養基上呈流動狀蔓延，末端形成樹杈狀蔓延形狀，并將培養基染成紅色。該紅色菌體生長迅速，24 h 后菌落為圓形，表面濕潤粘稠，有特殊臭味。通過將L9 菌株的16 S rDNA 基因序列與NCBI中已知的近源菌株進行多序列比對，利用MEGA7.0繪制系統發育樹（圖1），結合形態特征，最終將L9菌株鑒定為粘質沙雷氏菌（Serratia marcescensL9），保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC NO：M 2018694）。

圖1 Serratia marcescens L9 16S rDNA 進化樹分析

2.2 菌株發酵產物鑒定

利用UPLC-Q-TOF-MS/MS 對純化后的發酵產物進行定性分析，結果（圖2）顯示，其質譜分子量信息（324.2022）、碎片信息與文獻報道預測值（324.2070）、碎片信息一致［18-19］，可確定該樣品為靈菌紅素（Prodigiosin）。

圖2 靈菌紅素Q-TOF-MS/MS 圖譜

2.3 靈菌紅素分析方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備及線性關系考察 按1.2.3方法制備系列濃度的對照品溶液進樣測定，并進行線性回歸分析，計算相關系數。得回歸方程為y=8.49×106x-1.02×104，R2= 0.999 9（圖3-A），線性范圍0.005-0.16 mg/mL。

2.3.2 精密度、重復性和穩定性試驗 精密度試驗：取靈菌紅素對照品溶液，在上述色譜條件下重復進樣6 次，以其峰面積的相對標準偏差（RSD）來計算其精密度。結果顯示靈菌紅素的峰面積RSD 為3.2%，表明該方法精密度良好。

重復性試驗：按照1.2.3 供試品溶液制備方法，取同一發酵樣品制備供試品溶液平行6 組，經檢測分析，計算其含量及RSD。結果顯示靈菌紅素含量的RSD 為2.1%，表明該方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗中的一份供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h 時注入液相色譜儀，計算靈菌紅素峰面積，結果顯示峰面積RSD 為 1.7%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.3.3 加樣回收率試驗 取已知含量的靈菌紅素粗品0.1 g，分別按已知含量的80%、100%、120%三個水平加入對照品，按1.2.3 項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，注入液相色譜儀測定，計算加樣回收率。結果顯示靈菌紅素的平均回收率為98.27%，RSD 為2.9%，表明本方法準確性較好。

2.4 粘質沙雷氏菌L9菌體干重標準曲線的測定

將菌體干重與吸光值 OD600進行回歸分析，結果顯示（圖3-B）在0.235-0.795 區間呈現良好的線性關系（y=3.306x+0.599 2，R2=0.999 3）。

圖3 線性關系考察

2.5 粘質沙雷氏菌L9發酵條件優化

2.5.1 發酵時間對菌體生長與靈菌紅素產率的影響 粘質沙雷氏菌L9 菌株用酵母膏蔗糖培養基搖瓶發酵，以發酵時間為橫坐標，靈菌紅素產量和菌體干重為縱坐標繪制曲線圖。結果（圖4）顯示，30℃恒溫，180 r/min 培養下，菌株于接種后10 h 左右進入對數生長期，于28-36 h 達到最大值并進入穩定期，38 h 后進入衰亡期。處于對數生長期時的菌體靈菌紅素產量較低，菌體進入穩定期后大量合成，于38 h 接種后達到最大值約為74.4 mg/L，超過42 h 靈菌紅素含量開始降低。

圖4 粘質沙雷氏菌L9 菌株時間-生長曲線與靈菌紅素 產量

2.5.2 不同碳源對靈菌紅素產率的影響 如圖5-A所示，增加蔗糖、甘油、花生油、橄欖油和苦參種子油均能提高靈菌紅素產量，其中以添加苦參種子油的產率最高。添加苦參種子油到10 g/L 時靈菌紅素的產量可達到76.34 mg/L。

2.5.3 不同氮源對靈菌紅素產率的影響 如圖5-B所示，L9 菌株在牛肉膏做為氮源下能大量合成靈菌紅素，當牛肉膏添加量為5-10 g/L 時靈菌紅素產量為40.64 g/L，酵母膏、蛋白胨作為氮源靈菌紅素合成量較少，以硫酸銨或尿素為唯一氮源的情況下，L9 菌株不能產生靈菌紅素，生長基本停滯。

2.5.4 不同發酵溫度對靈菌紅素產率的影響 如圖5-C 所示，L9 菌株在28℃時菌體干重最高，菌體生長最適宜。30℃時菌體干重略有下降但靈菌紅素產量最高，溫度高于32℃時菌體干重和靈菌紅素產量逐漸降低，當溫度達到37℃時靈菌紅素的合成受到嚴重抑制。

2.5.5 金屬離子對對靈菌紅素產率的影響 如圖5-D所示，L9 菌株在鎂離子和鈣離子做為金屬離子時可大量合成靈菌紅素，且當鈣離子濃度為0.25 g/L 時靈菌紅素產量達到最大值約為162.11 mg/L；亞鐵離子、鋅離子和錳離子為金屬離子添加時靈菌紅素合成量少，L9 菌株幾乎不能產生靈菌紅素，生長基本停滯。

圖5 碳源、氮源、溫度及金屬元素對靈菌紅素產量的影響

2.6 響應面法優化發酵培養基

根據上述單因素試驗結果，選擇苦參種子油、牛肉膏和氯化鈣做爬坡試驗。苦參種子油濃度對靈菌紅素產量的影響結果（圖6-A）表明，靈菌紅素的產量隨著苦參種子油的添加量增加而增高，并在10 g/L 時達到最大，之后產量開始下降；牛肉膏濃度對靈菌紅素產量的影響結果（圖6-B）表明，靈菌紅素的產量隨著牛肉膏的添加量增加而增高，并在5-10 g/L 時達到最大，之后產量開始下降。氯化鈣濃度對靈菌紅素產量的影響結果（圖6-C）表明，靈菌紅素的產量隨著氯化鈣的添加量增加而增高，并在0.25-0.5 g/L 時達到最大，之后產量開始下降。

圖6 不同濃度苦參種子油、牛肉膏、氯化鈣對靈菌紅素產量的影響

考察因素確定后，采用Design-Expert8.0.6 中Box-Behnken 法設計因素17 組試驗（表1），結果見表2。

表1 Box-Behnken 試驗因素

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果

通過Design-Expert8.0.6 軟件對表2 中的試驗數據進行分析，經擬合得到L9 菌株靈菌紅素產量的多元回歸模型：靈菌紅素=258.08+49.98A+78.44B-31.74C+48.62AB-13.97AC-25.80BC-73.39A2-59.37B2-98.42C2。

回歸模型的分析結果如表3 所示，整個模型的P＜0.001，表明該回歸方程成立。失擬項值為0.765 8，大于0.05，不顯著，表明此回歸模型與試驗數據擬合度高，試驗誤差小，可用該模型分析并預測L9 發酵培養基中各主要因子對靈菌紅素產量的影響。方差檢驗顯示一次項中苦參種子油和牛肉膏的影響極為顯著，氯化鈣為高度顯著。二次項均是極為顯著，交互項中AB 高度顯著，BC 為顯著，表明各因素之間存在著交互作用。

表3 靈菌紅素回歸模型的統計分析

對此回歸模型進一步利用軟件分析，可得各個因素相互作用的響應面立體圖，見圖7。

各因子響應面曲線顯示交互作用顯著，擬合面有最大值。結果顯示，苦參種子油、牛肉膏和氯化鈣的最佳濃度分別為12.93 g/L、9.47 g/L 及0.3 g/L。經優化后的培養基稱為苦參種子油培養基，在30℃條件下，180 r/min 搖瓶發酵，靈菌紅素產量最高，預測產量為332.37 mg/L。

2.7 驗證試驗

為驗證模型的準確性，采用優化的苦參種子油培養基進行發酵。結果顯示，靈菌紅素實際產量平均值為317.21 mg/L，與模型預測的最大響應值基本吻合，比優化前初始產率提高近3.2 倍。

3 討論

圖7 苦參種子油、牛肉膏和氯化鈣對靈菌紅素產量交互影響的響應面曲線分析

有文獻報道，溫度對靈菌紅素的合成具有顯著影響，如粘質沙雷氏菌在低于20℃或高于37℃時基本不產生靈菌紅素［20］。本試驗中，單因素考察顯示L9 菌株在30℃時，靈菌紅素產量最高，但37℃靈菌紅素的產率顯著下降。Kurbanoglu 等［21］發現有機氮源較無機氮源更適合靈菌紅素的生產，實驗表明L9 菌株在牛肉膏做為氮源下能大量合成靈菌紅素，以硫酸銨或尿素為唯一氮源的情況下，L9 菌株幾乎不能產生靈菌紅素，生長基本停滯。實驗結果表明，金屬離子對L9 菌株靈菌紅素的產量有較大影響，Fe2+、Cu2+、Zn2+對靈菌紅素和菌體繁殖有抑制作用，Ga2+、Mg2+對靈菌紅素的合成有明顯的促進作用。據文獻報道，靈菌紅素合成的起始前體為脂肪酸或不飽和脂肪酸自氧化過程中產生的2-辛烯醛［22-23］，實驗結果表明粘質沙雷氏菌L9 利用苦參種子油時靈菌紅素產率最高。

目前，利用廢棄物產靈菌紅素已取得一定的成果，如Kurbanoglu 等［21］利用農業廢棄物羊角蛋白作為氮源，誘導粘質沙雷氏菌MO-1 發酵生產靈菌紅素，但靈菌紅素最高產率僅為277.74 mg/L。在已優化發酵條件下，以橄欖油、花生油分別代替苦參種子油發酵生產靈菌紅素的產率為237.33 mg/L、153.33 mg/L，顯著低于苦參種子油發酵生產靈菌紅素的產率317.21mg/L。橄欖油、花生油屬于食用性油脂，其成本相對較高，而苦參種子油脂是苦參種子深加工過程產生的副產物，其廉價易得，且苦參種子副產物油脂中含有一定量的生物堿和黃酮類物質，這些物質是廣譜的抗菌成分［24］。L9 菌株在極端環境下依然可以耐受并高效利用油脂類成分產生高附加值的靈菌紅素，由此可見L9 菌株在利用苦參種子等富含油脂類中藥廢棄物產靈菌紅素的過程中具有一定的應用前景。

4 結論

綜上所述，本研究成功篩選得到一株適宜于以中藥副產物為原料產靈菌紅素的粘質沙雷氏菌L9 菌株，并以苦參種子副產物油脂作為唯一碳源發酵生產靈菌紅素，優化獲得其最佳培養基組成和培養條件，在有效處置苦參種子固廢物的同時產生靈菌紅素高附加值產品，為苦參資源的提質增效提供了科學依據，也為種子類藥材深加工過程固廢物的資源化利用提供了借鑒。