穩定表達非洲豬瘟病毒P54 蛋白的Vero 細胞系的建立

王彩霞 杜方原 林祥梅 Grzegorz Wozniakowski 王勤 馮春燕 吳紹強

（1. 中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100176；2. 波蘭國家獸醫研究所豬病部，波蘭普瓦維 24-100）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種豬的烈性、高度接觸性傳染病［1］。1921 年，肯尼亞首次記錄了非洲豬瘟的爆發，目前非洲大陸次撒哈拉地區的大多數非洲國家均有流行［2］。該病于1957 年傳入歐洲南部地區，1971 年傳入加勒比海地區和南美洲，2007 年傳入高加索地區和俄羅斯，現在仍在非洲、南撒丁島、高加索地區以及俄羅斯流行［3］。世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將非洲豬瘟列為一類動物疫病，在《國家中長期動物疫病防治規劃（2012-2020）》中，ASF 被列為優先防范的13 種重大外來動物疫病之一。我國于2018 年也爆發了該病且呈現出繼續蔓延的趨勢，截至2019 年9 月5 日，我國已有32 個省、自治區、直轄市發生了ASFV 疫情，有關防控部門對疫區豬群進行了撲殺政策，從而導致我國目前豬肉價格急劇攀升，使得我國對該病的防控形勢十分 嚴峻［4-5］。

ASFV 屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，是一種有囊膜的雙鏈DNA 病毒，能夠在Vero 細胞，PAM 細胞及PAM 細胞系中增殖。病毒基因組全長為170 kb-190 kb，整個基因組含有151 個ORF，可以編碼150-200 個蛋白質，可以編碼的結構蛋白有54 種以上，包括P54、P72、P30 等。其中P54 蛋白存在于病毒粒子內層囊膜，是ASFV 重要的結構蛋白，由E183L 基因編碼。P54 蛋白的跨膜結構在病毒蛋白經內質網轉化成病毒包膜前體時起十分重要的作用。P54 蛋白可分泌到病毒體外，并以二硫鍵連接的I 型膜結合物形式感染細胞，而且感染細胞后在內質網膜處短暫表達［6］。動物實驗表明，弱毒株攻毒后7-10 d 即可檢測到P54 抗體［7］。用P54 蛋白建立的ELISA 抗體檢測方法，具有很高的敏感性，特異性和穩定性。本研究選擇P54 蛋白作為靶標，建立穩定表達P54 基因的單克隆Vero 細胞系，可用于非洲豬瘟抗體的檢測和確診，能有效縮短檢測時間且檢測過程中不涉及病原感染，降低了生物安全的要求。此外，建立的穩定表達P54 基因的單克隆Vero 細胞系還可能進一步用于非洲豬瘟病毒的致病機理的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清、抗體和細胞 鼠抗Azami Green（以下簡單標記為AG）的單抗、鼠抗β-Actin 的單抗、辣根酶標記的山羊抗鼠IgG、TRITC 標記的山羊抗鼠熒光抗體和TRITC 標記的兔抗豬熒光抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；滅活的ASFV 豬陽性血清，波蘭國家獸醫研究所保存。HEK293V 細胞、Vero 細胞和鼠抗P54 多抗，由中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM，FBS 購自Hyclone 公司；Trypsin-EDTA（0.25%），phenol red（GibcoTM） 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；phmAG1-MCLinker 購自上海浩然生物技術有限公司；慢病毒載體pLV-puro，輔助載體pH1、pH2，PEG 慢病毒純化試劑盒均購自北京英茂盛業生物科技有限公司；胰蛋白酶購自Amresco 公司；PolyFect 轉染試劑，Plasmid Plus Maxi Kit 質粒提取試劑盒，RNeasy Mini Kit 均購自Qiagen 公司；限制性內切酶MluI 和NotI，T4DNA 連接酶均購自TaKaRa 公司；EasyPfu DNA Polymerase、TransScript Green Two-Step qRTPCR SuperMix 購自北京全式金生物技術有限公司；Hoechst33342 和嘌呤霉素購自Sigma 公司；ECL 化學發光底物試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司；RIPA 裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒載體的構建 根據GenBank中已公布的ASFV P54 基因序列號（GenBank：FN557520.1）設計一對用于P54 基因擴增的特異性引物。其中，上游引物P54-F 為：5′-CGACGCGTCG ATGGATTCTGAATTTTTTCAAC-3′，下劃線處為MluI識別位點；下游引物P54-R 為：5′-CACGCTCACCA TTCCTTGGGTCGATCCTCCTCCTGAACCACC ACTACCACCCGATCCTCCGCCGCCCAAGGAGT TTTC-3′（其中斜體部分為P54 的基因序列，黑體加粗部分為鉸鏈區序列，未加粗部分為載體phmAG1-MCLinker 的基因序列），預期擴增片段大小為625 bp。針對phmAG1-MCLinker 設計一對用于Azami Green 基因序列擴增的特異性引物。其中，上游引物AG-F 為：5′-GAAAACTCCTTGGGCGGCGGAGG ATCGGGTGGTAGTGGTGGTTCAGGAGGAGG ATCGACCCAAGGAATGGTGAGCGTG-3′（其 中 斜體部分為P54 的基因序列，黑體加粗部分為鉸鏈區序列，未加粗部分為載體phmAG1-MCLinker 的基因序列），下游引物AG-R 為：5′-ATTTGCGGCCGCTTT ATTAGTCAGCGGAATTACCGGTCTT-3′（下劃線處為NotI 識別位點），預期擴增片段的大小為781 bp。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

分別以非洲豬瘟病毒DNA 和phmAG1-MCLinker載體為模板，以相應的特異引物擴增ASFV P54 基因序列和Azami Green 基因序列，膠回收兩PCR 產物1∶1 混合后，再以引物P54-F 和AG-R 進行搭橋PCR 擴增P54-Azami Green 基因的融合片段（P54-AG），預期融合片段的大小為1 328 bp。將P54-AG融合目的片段通過MulI 和NotI 酶切克隆至慢病毒載體pLV-puro 中，構建重組慢病毒表達質粒pLVASFV-P54-AG。以同樣的操作步驟構建pLV-AG質粒。

1.2.2 重組慢病毒的包裝 將HEK293V 細胞接種到90 mm 培養皿，當細胞匯合度為90%-95%時，通過PolyFect 轉染試劑將pLV-ASFV-P54-AG 與輔助質粒pH1 和pH2 共轉染HEK293V 細胞，轉染后48 h收集細胞培養上清，用PEG 慢病毒純化試劑盒純化病毒，分裝后置-80℃備用。以相同操作步驟，將pLV-AG 質粒與輔助載體共轉染HEK293V 細胞，以制備表達Azami Green 蛋白的慢病毒對照（以下標記為Vero-AG）。

1.2.3 慢病毒感染和細胞篩選 將Vero 細胞接種到35 mm 培養皿，將1.2.2 中純化的慢病毒懸液300 μL加入1.7 mL DMEM 培養基（含10%FBS），然后加入聚凝胺至終濃度為6 μg/mL，混合均勻，以其感染細胞密度為80%左右的正常Vero 細胞，24 h 后更換新鮮培養基，繼續培養24 h，將Vero 細胞消化后以200-500 個/皿的密度接種于培養皿，加入嘌呤霉素至終濃度為5 μg/mL 進行篩選，每隔2 d 換液一次，并重新添加嘌呤霉素。篩選2 周后不再死亡的細胞擴大培養后為多克隆細胞，消化后以有限稀釋法篩選單克隆細胞并將單克隆細胞擴大培養后，一部分凍存；一部分用于表達情況檢測。利用RNeasy?Mini Kit 提取擴大培養后的單克隆細胞總RNA，以TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒先將總RNA 反轉錄為cDNA，再以該cDNA 為模板進行雙重熒光定量RT-PCR，同時檢測ASFV-P54 和GAPDH 內參基因在Vero 細胞中的表達水平，表達水平高的單克隆細胞進行后續鑒定試驗。其中檢測ASFV-P54 基因表達的引物根據P54 基因序列設計，具體引物序列為：P54-RT-F2：5′-AAGATCAGCAA- TGGGCAGAAGT-3′，P54-RT-R2：5′-ACTGTCGTGTAAGGCTCAGTCG-3′；內參基因GAPDH 的引物參照文獻［8］，具體引物序列為：GAPDH-F：5′-AACGG- ATTTGGTCGTATTGGG-3′，GAPDH-R：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。上述引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2.4 細胞系的Western Blot 鑒定 收集1.2.3 中篩選的約106個單克隆Vero 細胞以RIPA 裂解液提取總蛋白進行SDS-PAGE 檢測后半干轉印至PVDF 膜上，分別以鼠抗Azami Green 的單抗（1∶1 000），鼠抗β-actin 的單抗（1∶1 000），鼠抗P54 的多抗（1∶8 000）為一抗，采用HRP 標記的山羊抗鼠單抗做1∶5 000 稀釋后作為二抗，通過ECL 系統顯影，拍照，記錄檢測結果，篩選出最佳表達ASFV-P54的細胞系命名為Vero-AG-ASFV-P54。

1.2.5 細胞系的間接免疫熒光鑒定 制備Vero-AGASFV-P54、Vero-AG 和Vero 三種細胞的細胞爬片，以5% BSA 封閉1 h 后，以5% BSA 做抗體稀釋液，分別以鼠抗Azami Green 的單抗（1∶1 000）、SPF豬陰性血清（1∶50）、鼠抗P54 的多抗（1∶1 000）和ASFV 感染豬陽性血清（1∶50）作為一抗，以TRITC 標記的山羊抗鼠熒光抗體（1∶100）和TRITC 標記的兔抗豬熒光抗體（1∶100）作為二抗對細胞進行熒光染色，利用熒光顯微鏡觀察檢測結果（該實驗在波蘭國家獸醫研究所進行）。

2 結果

2.1 重組慢病毒質粒的構建

利用設計的特異引物采用兩輪PCR 搭橋擴增的方法，獲得P54-AG 融合目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，目的片段大小為1 328 bp，與預期大小一致。膠回收目的片段，雙酶切后克隆至慢病毒載體pLV-puro 中，構建成重組慢病毒表達質粒pLV-ASFV-P54-AG。重組質粒測序結果表明，P54 基因序列、插入位置以及閱讀框準確無誤。

圖1 ASFV-P54 基因與Azami 綠色熒光蛋白的融合片段電泳圖

2.2 重組慢病毒的包裝

利用PolyFect 轉染試劑將重組慢病毒質粒pLV-ASFV-P54-AG 與 輔 助 質 粒pH1 和pH2 共 轉染HEK293V 細胞，轉染48 h 后觀察細胞是否存在CPE 現象，然后收集重組慢病毒，結果顯示，未見HEK293V 細胞出現明顯CPE。

2.3 穩定表達ASFV-P54蛋白的細胞系的篩選

在6 μg/mL 聚凝胺的作用下，將重組慢病毒感染Vero 細胞，經過嘌呤霉素篩選最終獲得多株可表達ASFV-P54 蛋白的Vero 單克隆細胞株，為選擇一株表達量較高的穩定細胞株，對單克隆細胞株進行了ASFV-P54 和GAPDH 兩基因的雙重熒光RT-PCR檢測，比較每株單克隆細胞株ASFV-P54 基因的表達量。篩選結果見圖2，從圖中可以看出，P54-21和P54-24 兩株單克隆細胞的表達量較高。

圖2 ASFV-P54 基因在Vero 細胞系中相對表達量的熒光RT-PCR 檢測統計結果

2.4 細胞系的western Blot鑒定

用RIPA 細胞裂解液分別提取P54-21、P54-24、Vero-AG 和Vero 細胞的細胞總蛋白進行SDS-PAGE，分別以鼠抗Azami Green 的單抗，鼠抗β-actin 的單抗，鼠抗P54 的多抗為一抗，用HRP 標記的山羊抗鼠單抗做二抗進行Western Blot 檢測。通過比較P54-21 和P54-24 細胞中P54 蛋白的表達水平，可以看出P54-24 細胞系中P54 的表達水平明顯高于P54-21 細胞系中P54 的表達水平（43 kD 大小的條帶），因此將P54-24 命名為Vero-AG-ASFV-P54，用于后續進一步的鑒定。從圖中（圖3）我們可以看出，Vero-AG 細胞對照只有一條26 kD 的帶，顯示Azami Green 已經表達；而Vero 細胞可見只有β-actin 有表達，既沒有P54 蛋白帶也沒有Azami Green 蛋白帶；P54-21 和P54-24 下方均有一條Azami Green 蛋白帶，我們推測可能是由于P54 蛋白降解所導致的。

圖3 穩定表達ASFV P54 基因的Vero 細胞的Western Blot 鑒定結果

2.5 細胞系的IFA鑒定

制 備Vero-AG-ASFV-P54、Vero-AG 和Vero 三種細胞的細胞爬片，以鼠抗Azami Green 抗體、鼠抗P54 的多抗和ASFV 感染豬陽性血清作為一抗，TRITC 標記的山羊抗鼠熒光抗體和TRITC 標記的兔抗豬熒光抗體作為二抗進行IFA 鑒定。鑒定結果顯示，通過慢病毒包裝系統構建的穩定表達非洲豬瘟病毒P54 蛋白的Vero 細胞（Vero-AG-ASFV-P54）不僅能夠與鼠抗P54 蛋白的多抗發生特異性反應（圖4），而且還能被ASFV 感染豬陽性血清識別（圖5），同時還可觀察到ASFV P54 蛋白的綠色點狀熒光信號（圖4、圖5，Azami Green），能夠與多抗或豬陽性血清的紅色染色信號（圖4、圖5，pAb ASFVP54/positive ASFV Serum）發生共定位（圖4，圖5，Merge），與陰性血清則無反應（圖5，Negative serum）。而Vero 細胞和Vero-AG 細胞對照與P54 多抗、ASFV 感染的豬陽性血清均不發生反應（圖4、 圖5）。

圖4 穩定表達ASFV P54 基因的Vero 細胞（Vero-AG-ASFV-P54）與P54 多抗反應的IFA 結果

圖5 穩定表達ASFV P54 基因的Vero 細胞（Vero-AG-ASFV-P54）與ASFV 感染豬血清反應的IFA 結果

3 討論

ASF 可通過與野豬接觸、受污染的豬制品和媒介昆蟲傳播［9］。除非洲外，該病已經在美洲、歐洲等多個國家發生，2018 年該病傳入我國，導致我國畜牧業損失重大，非洲豬瘟防控形勢嚴峻。為了維持我國畜牧業健康持續發展，保護國民身體健康以及維護國家利益，開展該病的檢測技術研究具有重大意義。

隨著非洲豬瘟疫苗開始進入臨床階段，針對該疫病的抗體檢測迫在眉睫。目前抗體的檢測主要依賴國外進口試劑盒，國內沒有成熟的商品化試劑盒，這些試劑盒成本昂貴，更重要的是試劑盒檢測結果不能作為確診方法，必須進行免疫熒光（IFA）方法進一步驗證［10］。

基于病毒學的IFA 研究方法，該方法是OIE 推薦的實驗室確診方法［11］。但該方法需要病毒感染敏感細胞過程。目前非洲豬瘟主要感染原帶豬肺泡巨噬細胞，獲取原帶豬肺泡巨噬細胞需要較高的實驗條件［12］。研究表明，在Vero 細胞系中，有些非洲豬瘟病毒也能復制，但存在滴度不高的現象。因此利用IFA 對抗體陽性血清進行確證，操作繁瑣耗時長，且涉及生物安全的問題，因此應用范圍受限，亟需該方法的替代方法。目前已有很多烈性傳染病利用穩定克隆細胞系表達病毒蛋白來替代IFA 的方法，如Balamurugan 等［13］利用穩定表達H 蛋白的穩定克隆細胞系來檢測小反芻獸疫抗體陽性，張永寧等［14］利用BHK-21 細胞建立的穩定表達施馬倫貝格病毒N 蛋白的穩定克隆細胞系，為SBV 血清抗體的檢測提供了備用材料。

本研究利用Vero 細胞首次建立了非洲豬瘟主要抗原P54 蛋白的穩定單克隆Vero 細胞系，利用Vero細胞穩定表達帶有Azami Green 熒光標簽P54 蛋白具有高效的生物活性，能夠與P54 多抗和ASFV 陽性血清發生特異反應，在熒光顯微鏡下可以清晰的觀察到熒光信號，而對照細胞則沒有，整個操作過程無需活病毒感染，在普通條件下即可對樣品進行確診，且有效縮短了檢測時間。這表明該細胞系有望成為非洲豬瘟感染后抗體檢測和確診的重要研究材料。且通過進一步的研究，該穩定單克隆Vero 細胞系還能用于非洲豬瘟病毒致病機理的研究，其應用范圍有待于進一步的深挖探究。

4 結論

本研究成功構建了pLV-ASFV-P54-AG 慢病毒表達系統，并且篩選到了一株能夠高效穩定表達ASFV-P54 蛋白的Vero 細胞株，可以在不違背生物安全要求的情況下用于非洲豬瘟血清抗體的檢測，應用前景廣闊。