基于比濁法的桿菌肽定量測定方法優化

王志新 劉洋 周景波 宏丹 魯雷震 寧亞維 賈英民

（1. 河北科技大學生物科學與工程學院 河北省發酵工程技術研究中心，石家莊 050018；2. 北京工商大學食品與健康學院，

北京 100048）

抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP），是一種普遍存在于動植物及微生物體內的具有抗菌生物活性的小分子多肽類物質的總稱［1］。相關研究表明，抗菌肽的抗菌機制和抗生素的不同，相較于抗生素而言，其不易產生耐藥性，且抗細菌、真菌病毒以及腫瘤［2］。近幾年，關于抗菌肽作為抗生素理想替代品的研究引發了學者們的極大興趣［3］。

抗菌肽種類多樣，常見的有植物防御素、天蠶素、桿菌肽、乳酸鏈球菌素、多黏菌素B 等［4］，桿菌肽是其中較為重要的一種。桿菌肽（Bacitracin）是由地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物通過發酵合成的短肽類抗菌素，可有效抑制革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌，具有抗菌譜廣的特點［5］。1943年，美國哥倫比亞大學研究人員首次從患者的脛骨創傷污染物中分離得到產生抗菌物質的地衣芽孢桿菌，并經發酵獲得了桿菌肽的成品［6］。1960 年，美國批準將桿菌肽作為飼料添加劑，這使得桿菌肽的開發和應用得到了快速發展［7］。隨著科學的不斷進步，人們對桿菌肽特性的了解也越來越深入，桿菌肽的應用必將會隨著研究的不斷深入而更加廣泛［8］。國外桿菌肽定量測定方法常采用微生物檢定法，如管碟法、濁度法以及高效液相色譜定量測定法［9-10］， 且這些方法均已被國際藥典和各國藥典收錄［11-13］。國內常用的方法參考藥典，有管碟法、濁度法 等［14-15］，但是藥典中沒有對試驗菌的初始濃度和培養時間等因素的具體規定［16］。因此，如何準確的測定桿菌肽的抗菌活性就成為了一個有待解決的問題。

長期以來，管碟法由于不需要特殊材料，成本低［17］，而成為測定抗菌物質活性最常用的方法，但是該法耗時長、對操作人員經驗要求較高、人為影響因素多。與管碟法相比，比濁法有靈敏度高、耗時短、易操作、采用液體培養法無擴散因素影響、人為因素少等優點［18］。比濁法是利用抗菌物質在液體培養基中對指示菌生長的抑制作用，其渾濁程度與活菌數的增加、菌體質量的增加等存在著直接的關系，通過測定培養后細菌濁度值的大小來表示對實驗菌生長抑制的程度［19］。《中國藥典》2005 年版抗生素微生物檢定法新增了濁度法測定方法［20］。1952 年，Berridge 和 Barrett［21］首次應用微孔比濁法來測定抗生素效價，經過不斷改進，該法已成為可以定量測定抗菌物質的一種方法［22］，但是，必須使用酶標儀這一條件限制了微孔比濁法的廣泛應用，若可以利用分光光度計比濁法必然會極大提高其應用普遍性［23］。

本實驗采用分光光度計比濁法，以桿菌肽和沙門氏菌為例，以重復性和精密度作為指標，對比濁法試驗中所涉及的指示菌初始濃度、桿菌肽溶液與菌懸液的比例、培養時間的影響進行探討，并對各影響因素進行優化，確定其定量測定的最佳試驗條件。同時，采用桿菌肽和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行重復驗證試驗，期望得到重復性好、精密度高、具有高適用性的桿菌肽定量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沙門氏菌ATCC 14028、大腸桿菌ATCC 44752、金黃色葡萄球菌ATCC 25923：購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養基 營養肉湯培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，加水至1 000 mL，115℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑 桿菌肽（效價＞60 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）：取磷酸氫二鉀2 g 與磷酸二氫鉀8 g，加水至1 000 mL，115℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器設備 紫外可見分光光度計：美國Thermo 公司；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫搖床：上海智城分析儀器制造公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將活化后的沙門氏菌菌株以1%的接種量接種于營養肉湯培養基中培養至穩定期，10 000 r/min 離心5 min 取菌體，用生理鹽水洗滌3 次，將菌體重懸于生理鹽水中，再按一定比例加入液體培養基備用。

1.2.2 桿菌肽溶液的配制 準確稱取桿菌肽100 mg，溶于10 mL 磷酸緩沖液中配制成10 mg/mL 的母液，再精確吸取適量母液，用磷酸緩沖液稀釋成不同濃度備用。

1.2.3 培養方式選擇 按照1.2.1 的實驗方法制備初始濃度相同的菌懸液，37℃，分別靜置培養和振蕩培養4 h，比較細菌生長情況。

1.2.4 桿菌肽濃度與吸光度線性關系的驗證 在各試驗管內加入含有沙門氏菌懸液的培養基9.0 mL，再分別加入各濃度桿菌肽溶液1.0 mL，立即搖勻，每一劑量采用3 個試管，于37℃恒溫搖床培養4 h，取出，立即于紫外分光光度計600 nm 處測定吸光度；同時另取2 支試管分別加入磷酸緩沖液1.0 mL，再分別加入含有沙門氏菌懸液的培養基9.0 mL，其中一支試管與上述各管同法操作作為細菌生長情況的陽性對照，另一支立即混勻，作為吸光度測定的空 白液。

以桿菌肽終濃度的對數值為橫坐標，以OD600為縱坐標，繪制抗菌肽濃度對數值與OD600之間的線性關系，驗證二者之間是否存在線性關系。

1.2.5 抑菌測定方法的優化

1.2.5.1 指示菌初始濃度優化 按照1.2.1 的實驗方法分別制備初始濃度為106、107、108CFU/mL 的菌懸液，然后按照1.2.4 的實驗方法進行實驗

1.2.5.2 桿菌肽溶液與菌懸液比例優化 按照1.2.1的實驗方法制備指示菌初始濃度為107CFU/mL 的菌懸液，調整桿菌肽溶液與菌懸液比例分別為1∶1、1∶4、1∶9，其余條件然后按照1.2.4 的實驗方法 進行。

1.2.5.3 培養時間優化 按照1.2.1 的實驗方法制備指示菌初始濃度為107CFU/mL 的菌懸液，調整培養時間分別為4 h、6 h、8 h，其余條件按照1.2.4 的實驗方法進行。

以上優化，每個試驗設置3 個平行，每個平行重復3 次。建立桿菌肽濃度對數值與吸光度之間的線性回歸方程，以回歸方程的相關系數R2、斜率、截距以及相對標準偏差為依據，進行方法重復性、精密度、準確度的優化。

1.2.6 驗證試驗 為進一步驗證試驗的可行性，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別進行實驗。

2 結果

2.1 培養方式選擇

指示菌初始濃度保持一致，其他培養條件一樣，分別振蕩和靜置培養相同時間，比較OD600的變化情況，結果見圖1。振蕩培養相較于靜置培養OD 值增量明顯，靜置培養OD 值增量太小，會導致后續實驗結果誤差較大，因此培養方式選擇振蕩培養。

2.2 桿菌肽濃度對數值與OD600線性關系的驗證

圖1 振蕩培養和靜置培養OD 增量比較

本實驗參考中國藥典，采用比濁法，利用桿菌肽在液體培養基中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養后細菌濁度值的大小，尋找合適的桿菌肽濃度，使桿菌肽濃度對數值與吸光度OD 值呈現線性關系，結果見圖2 和表1。結果表明，在桿菌肽溶液終濃度為0.4-0.8 mg/mL 濃度范圍內，桿菌肽濃度的對數值與OD600之間存在良好的線性關系，其相關系數R2均達到 0.99 以上。3 次重復測定的結果相對偏差均較小，可見其準確性和精密度較好。

圖2 桿菌肽濃度對數值與OD600 的線性關系

表1 桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結果分析

2.3 抑菌測定方法的優化

2.3.1 指示菌初始濃度優化 分別制備106、107、108CFU/mL 的菌懸液，進行抑菌實驗，繪制桿菌肽濃度對數值與OD600之間的線性回歸方程，結果見圖3。不同的指示菌初始濃度對斜率、截距及線性相關系數的結果見表2。

圖3 指示菌初始濃度對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028的影響

表2 指示菌初始濃度對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028的結果分析

當指示菌初始濃度為106、108CFU/mL 時，線性關系較差，線性相關系數均低于0.99，且當指示菌初始濃度為106CFU/mL 時，截距的RSD%超出范圍；當指示菌濃度為107CFU/mL 時，斜率和截距的相對偏差均較小，線性相關系數為0.991 4，精密度良好，因此選擇107CFU/mL 為最佳指示菌初始濃度。另外由圖3 可以看出，指示菌初始濃度太高，抑制作用不明顯；指示菌初始濃度太低，低濃度的桿菌肽就可以完全抑制菌體的生長。

2.3.2 桿菌肽溶液與菌懸液比例優化 桿菌肽溶液與菌懸液比例分別為1∶1、1∶4、1∶9，進行抑菌實驗，繪制桿菌肽濃度對數值與OD600之間的線性回歸方程，結果見圖4。不同的桿菌肽溶液與菌懸液比例對斜率、截距及線性相關系數的結果見表3。當桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶1、1∶4 時，線性關系較差，精密度差，且截距的相對標準偏差超出范圍；當桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶9 時，線性關系系數為0.991 5，斜率和截距的相對偏差均較小，因此選擇桿菌肽溶液與菌懸液的最佳比例為1∶9。

2.3.3 培養時間優化 培養時間分別為4 h、6 h、8 h，進行抑菌實驗，繪制桿菌肽濃度對數值與OD600之間的線性回歸方程，結果見圖5。不同的培養時間對斜率、截距及線性相關系數的結果見表4。

圖4 桿菌肽與菌懸液比例對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的影響

表3 桿菌肽與菌懸液比例對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結果分析

圖5 培養時間對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的影響

表4 培養時間對桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結果分析

當培養時間為6 h 和8 h 時，線性關系較差，線性相關系數均低于0.99，且此時截距的RSD%超出范圍；當培養時間為4 h 時，斜率和截距的相對偏差均較小，線性相關系數為0.992 6，精密度良好，因此選擇4 h 為最佳培養時間。

實驗所用的菌懸液必須新鮮配制，否則實驗誤差大，因實驗菌放置一段時間后，細胞老化死亡，但濁度不會因此改變，從而影響實驗時的活菌數［24］。

2.4 驗證試驗

采用大腸桿菌ATCC 44752 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 對上述建立的抑菌定量測定方法進行驗證，結果見圖6、7 和表5、6。

圖6 大腸桿菌驗證試驗的桿菌肽濃度對數值與OD600 的線性關系

圖7 金黃色葡萄球菌驗證試驗的桿菌肽濃度對數值與OD600 的線性關系

通過大腸桿菌驗證試驗，可以得出，桿菌肽溶液終濃度為0.2-0.6 mg/mL 范圍內時，OD600為0.1-0.6，桿菌肽濃度的對數值與OD600之間存在良好的線性關系，其相關系數R2均達到 0.99 以上；通過金黃色葡萄球菌驗證試驗，可以得出，桿菌肽溶液終濃度為0.003-0.007 mg/mL 范圍內時，OD600為0.0-0.4，桿菌肽濃度的對數值與OD600之間存在良好的線性關系，其相關系數R2均達到 0.99，以上得出結果表明精密度和重復性均良好，驗證了此方法的可行性。

表5 桿菌肽抑制大腸桿菌ATCC 44752 的結果分析

表6 桿菌肽抑制金黃色葡萄球菌ATCC 25923 的結果分析

3 討論

比濁法與管碟法相比，采用液體培養基，無擴散因素的影響；試驗培養3-4 h，當天就可獲得結果，具有快速靈敏、精密度好的優點［25］。比濁法常用于抗生素的抑菌性能研究中。潘強等［26］建立了比濁法測定可利霉素片效價的方法，以金黃色葡萄球菌為試驗菌，菌懸液添加量為0.5%，溫度為（37±0.5）℃，培養時間3.5-4.0 h 測定，抗生素線性最佳濃度范圍為6.4-15.7 U/mL。周志敏等［27］采用比濁法測定氯霉素效價，氯霉素溶液在3-8 U/mL 濃度范圍內，濃度與吸收度呈良好的線性關系。國內該方法一般用于抗生素的效價測定中，而進行抗菌肽的定量測定的研究還較少。佟斌等［28］建立了硫酸多黏菌素E 的比濁法快速測定方法，當硫酸多黏菌素E 的效價為30-100 U/mL 時，試驗菌液接種濃度為5%，培養時間為4 h，吸光度對數值與硫酸多黏菌素E 效價具有良好的線性關系。目前，國內采用比濁法測定桿菌肽抑菌活性的研究較少，還未形成完善的定量測定標準。

4 結論

通過比濁法優化，獲得桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的最佳測定條件：指示菌的初始濃度為107CFU/mL，桿菌肽終濃度為0.4-0.8 mg/mL，桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶9，培養時間為4 h。在此條件下，線性關系良好，R2達到0.99 以上，為進一步驗證此方法的可行性，選用大腸桿菌ATCC 44752 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 進行研究，結果重復性好，精密度高。

本研究建立的基于桿菌肽濃度對數值與吸光度之間線性關系的定量測定方法具有快速準確、操作簡便、重復性好、普適性高等特點，可以廣泛應用于桿菌肽的相關研究。