雙氫青蒿素對急性肺損傷大鼠炎癥機制的研究

張楊 王榮麗

急性肺損傷是指各種肺內外因素導致的肺部嚴重并發癥，其病理生理改變為：嚴重的炎癥反應、肺泡-毛細血管屏障損傷、氧化應激、異常活化的凝血等，使肺組織損傷及水腫，導致動脈氧合不足，出現低氧血癥。臨床上病人表現為進行性的呼吸困難，甚至呼吸窘迫。ALI是導致急性呼吸衰竭甚至多器官功能衰竭的主要原因[1]。多種全身或局部因素可誘發AL,如膿毒癥、肺炎、嚴重創傷等，其中細菌性肺炎是臨床上常見的誘因。研究表明細菌性肺炎和繼之而來的ALI/ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)是重癥患者發病和死亡的主要原因[2]；近年來，隨著細菌分離株中抗生素耐藥性的發生率迅速增加。找到新的輔助方法改善的ALI/ARDS愈后，顯得尤為重要。

肺泡巨噬細胞是肺部防御機制的第一道防線，被認為可能是 ALI 的啟動因子，研究已證明，巨噬細胞在不同微環境刺激下可以發揮抗炎或促炎兩種截然不同的作用，其機制是通過干預巨噬細胞的極化：經典活化型巨噬細胞(M1)和替代活化型巨噬細胞(M2)的失衡實現的。其中M1主要發揮炎癥作用；而M2主要促進炎癥的轉歸。如2型糖尿病患者體內存在M1/M2的失衡，促炎型M1細胞明顯增加, 在糖尿病大血管并發癥和糖尿病腎病患者中這種失衡更明顯[3]。

青蒿素及其衍生物有抗炎、免疫調節、抗腫瘤的作用[4-6]，雙氫青蒿素可調控炎癥因子的表達，發揮抗炎作用。但目前尚無研究報道雙氫青蒿素影響急性肺損傷中巨噬細胞的極化。本實驗將通過大腸桿菌誘導大鼠急性肺損傷模型，來探討雙氫青蒿素抗炎及對ALI時巨噬細胞極化的影響。

材 料

一、菌株

大腸桿菌ATCC25922由西南醫科大學醫學檢驗科提供；實驗前使用麥氏比濁法將細菌濃度調整為3×108cfu/mL備用。

二、試劑

TNF-α、VEGF、IL-10 Elisa試劑盒(96t 酶聯生物)；Trizol(天根公司)，雙氫青蒿素(純度≥98% 805D021)、RPMI1640培養基(北京索萊寶公司)；逆轉錄試劑盒(TAKARA公司)；SYBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystem公司)。

三、儀器

干燥箱(上海博迅實業有限公司)；-80°冰箱(日本sanyo公司)，37℃恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；550型酶標儀(北京普朗新技術有限公司)；臺式離心機(上海安亭科學儀器廠生產 )；熒光定量PCR擴增儀(CFX-Connect96 美國伯樂公司)。

四、實驗動物

SD大鼠由成都達碩實驗動物有限公司提供(批號：scxk(川)2015-030)，體重180～220g。飼養在西南醫科大學實驗動物中心，飼養環境：室溫22～25℃，室內空氣濕度50%～60%，白天和黑夜各12 h，獨自攝食、飲水。

方法和結果

一、模型制備及取材參考文獻

40只雄性SD大鼠編號1～40，由SPSS軟件生成隨機數列分為五組大腸桿菌組(E-coli)、對照組(Control)、雙氫青蒿素低劑量組(low 5 mg·kg-1)、雙氫青蒿素中劑量組(Medium 15 mg·kg-1)、雙氫青蒿素高劑量組(High 25 mg·kg-1)。每組8只；大鼠適應性喂養6 d后，雙氫青蒿素采用植物油溶解，雙氫青蒿素低、中、高劑量組分別予以對于劑量雙氫青蒿素連續灌胃3 d，1天2次[7-9],大腸桿菌組和對照組予以同等劑量生理鹽水灌胃；最后一次灌胃處理后1 h，腹腔水合氯醛麻醉大鼠，直視下大腸桿菌組、雙氫青蒿素低、中、高劑量組分別于氣管內滴入大腸桿菌0.5mL (3×108)造模[10-11]。造模后24 h，水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈取血，常溫下靜置30min，4℃，3000 r·min-1離心10 min，取血清-80℃保存；開胸取右肺中葉、右下肺葉，分別行蘇木精-伊紅(HE)染色、肺濕干質量比；結扎斷端，暴露、游離氣管，行肺泡灌洗：22G留置針插入主支氣管，抬高大鼠頭部，3mLPBS分三次灌入，回收率約60%；灌洗液放置無酶EP管內，4℃2500rmp離心10 min收集上清于-80°冰箱保存；細胞沉渣用RMP1640重懸、洗滌細胞，離心，去上清，加入1mL Trizol,-80℃保存。

二、肺組織病理評分

右肺中葉取出后立即放入4%甲醛溶液固定，常規脫水、包埋切片，HE染色，光鏡下觀察病理損傷情況。肺臟組織病理評分參照smith評分系統[12]。對肺水腫、肺泡及間質炎癥、肺泡及間質出血、肺實變形成，分別進行0～4分的半定量分析：無損傷0分，病變范圍<25%為 1 分，病變范圍占 25%～50%為2分，50%～75%為3分，病變滿視野為4 分，肺損傷評分為上述各項之和。

三、肺濕干質量比(W/D)

取出大鼠右肺下葉，稱濕質量后置于烤箱(60℃24 h)烤到恒定質量，稱干質量，W/D計算公式：濕重/濕重-干重。

四、ELisa法測肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10

將-80℃存儲的肺泡灌洗液、血清，按照試劑盒操作方法測肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度。

五、RT-PCR 法檢測大鼠肺泡灌洗巨噬細胞Arg-1、iNOS、IL-1ra、IL-1β的mRNA表達

從-80℃冰箱中取出含trizol的大鼠肺泡巨噬細胞，按逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板用SYBR Green PCR試劑盒進行熒光定量PCR擴增。通過分析儀器讀取CT值，用2-ΔΔCT分析基因的相對表達量，以β-actin 為內參。引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成(見表1)。

表1 Arg1、iNOS、IL-1ra、IL-1β引物序列

六、統計學分析

七、結果

1 各組大鼠肺組織HE染色及病理評分

Contol組肺泡結構完整，未見明顯病理改變；E-coli組可見肺泡結構破壞；肺間隔明顯增寬，肺間質水腫、出血，肺內大量炎癥細胞的浸潤；雙氫青蒿素Low組可見肺泡結構破壞，肺間隔明顯增寬，間質水腫，肺內炎癥細胞浸潤；Medium組肺泡結構破壞，可見間隔增寬，水腫及炎癥細胞浸潤程度減輕；High組肺泡結構破壞，間隔增寬，水腫及炎癥細胞浸潤明顯減輕。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(×10)

A：E-coli組； B：Control組；C：Low組(5 mg·kg-1)；D：Medium組( 15 mg·kg-1)；E ：High組(25 mg·kg-1)

2 各組大鼠肺組織病理評分 Simth評分評估大鼠肺組織病理損傷：其中與Control組比較，E-coli組的肺組織評分明顯升高(P<0.05)；DHA灌胃治療，與E-coli組比較，Low、Medium、High組肺組織Smith評分降低，其中Medium、High組smith評分明顯降低(P<0.05)；提示雙氫青蒿素可減輕大腸桿菌造成的肺組織損傷(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織Smith評分

vsE-coli#P<0.05，vscontrol*P<0.05

3 肺組織濕干質量(W/D)比 肺W/D比主要反應肺組織水腫情況，其中E-coli組肺組織W/D比較Control組明顯升高(P<0.05)，雙氫青蒿素Low、Medium、High組治療可減輕ALI 大鼠的 W/D 比，其中Medium、High組smith評分比E-coli明顯降低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠肺組織W/D

vsE-coli；#P<0.05，vscontrol*P<0.05

4 血清及支氣管肺泡灌洗液TNF-α、VEGF、IL-10濃度 Elisa試劑盒檢測各組血清、BALF中細胞因子：其中與Control組比較，E-coli組灌洗液、血清中TNF-α、VEGF濃度明顯升高(P<0.05)，灌洗液、血清中IL-10濃度明顯降低(P<0.05)；DHA治療后，與E-coli組比較，Low、Medium、High組大鼠灌洗液中TNF-α、VEGF濃度明顯降低(P<0.05)；IL-10的濃度明顯升高(P<0.05)(見表4、5)

表4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

表5 各組大鼠血清中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度濃度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

5 大鼠支氣管肺泡灌洗液巨噬細胞Arg1、iNOS 、IL-1ra、IL-1βmRNA表達情況 PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞表型：其中與Control組比較，E-coli組大鼠巨噬細胞Arg1、IL-1ra mRNA表達減弱，iNOS 、IL-1β mRNA表達增強(P<0.05)，巨噬細胞表型以M1為主；與E-coli組比較，Medium、High組DHA灌胃后Arg1、IL-1ra mRNA表達增強，Low組僅Arg1表達增強，而Low、Medium、High iNOS、IL-1β mRNA表達均減弱(P<0.05)，巨噬細胞表型以M2為主(見圖2、3)。

圖2 各組大鼠支氣管肺泡巨噬細胞iNOS、Arg-1amRNA表達情況

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

圖3 各組大鼠支氣管肺泡巨噬細胞IL-1β、IL-1ramRNA表達情況

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

討 論

ALI/ARDS是一類嚴重的肺部并發癥，其病情危重，死亡率高，造成沉重的經濟負擔。誘導ALI的方式有很多，LPS是誘導ALI/ARDS最常見的方法，但內毒素并不完全等同于細菌所致的ALI，采用大腸桿菌能更好的模擬細菌性肺炎所致ALI的生理病理過程，更符合臨床實際，同時大腸桿菌也常常作為誘導實驗性ALI的替代物[13-14]。本實驗采用直視下氣管內滴入大腸桿菌方法成功誘導急性肺損傷模型，大鼠表現出精神萎靡、打噴嚏、呼吸急促。光鏡下病理切片可見肺泡結構破環、肺間質增寬、間質水腫、大量炎癥細胞浸潤。Smith評分幾乎能涵蓋ALI肺臟病理損傷的全部表現，可半定量評估肺的炎癥程度[15].模型大鼠病理切片顯示Smith評分明顯升高。肺水腫是ALI重要病理改變。評估肺水腫最簡單且最重要的的方法是W/D比。而VEGF是另一種有效評估肺水腫的炎癥因子。因為VEGF能夠對肺泡毛細血管膜的上皮和內皮均產生影響，其對血管通透性的誘導作用是組胺的20000倍[16]。在將VEGF156腺病毒輸送至大鼠肺內的研究中，大鼠呈現出非心源性肺水腫、肺組織毛細血管通透性增加、肺W/D比增加[17]，表明VEGF參與ALI肺水腫過程。本實驗同時采用W/D比及VEGF濃度評估肺水腫，發現大腸桿菌誘導大鼠肺組織W/D比及VEGF都呈不同程度的升高，其升高趨勢是一致的。

青蒿素作為傳統中藥，除了抗瘧疾作用外，還具有抗炎、免疫調節、抗腫瘤等特點[4,17-18]。青蒿素可以減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、黏附因子的表達，抑制中性粒細胞的浸潤等，發揮抗炎作用[5-6]。雙氫青蒿素(DHA)作為青蒿素衍生物中的一種，它不僅具備青蒿素的所有藥理特點，同時它的副作用更小，藥效更高。隨著雙氫青蒿素研究的深入，發現雙氫青蒿素可抑制NF-κB通路而抗炎[19]；在博來霉素誘導的肺纖維化模型中，雙氫青蒿素可以抑制纖維增生[6]；在LPS誘導的小膠質細胞炎癥中，雙氫青蒿素可以抑制iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表達[20]。本實驗中，雙氫青蒿素減輕大腸桿菌所致急性肺損傷的smith評分，呈劑量依賴性。DHA同樣減輕大腸桿菌所致急性肺損傷的W/D。目前研究針對DHA對VEGF的作用機制主要是抗腫瘤：DHA通過抑制VEGF的表達及腫瘤血管的形成誘導腫瘤細胞的凋亡[17-18]；針對DHA對ALI中炎癥所致VEGF的調節，尚未有報道。本實驗對各組大鼠肺組織及血清中VEGF進行檢測，發現DHA同樣減輕急性肺損傷大鼠體內的VEFG濃度，說明，DHA可以降低大腸桿菌誘導的急性肺損傷中VEGF。DHA通過減輕W/D比及VEGF來減輕肺水腫。但具體的機制還需要進一步研究。

炎癥細胞在ALI的發生發展中起著非常重要的作用，既往認為中性粒細胞是ALI中最重要的細胞。但隨著研究進展，發現巨噬細胞的在ALI的發生發展亦中起著舉足輕重的作用。肺巨噬細胞被認為是肺部防御的第一道防線，是ALI的啟動因素。肺巨噬細胞并非為單一的活化形式，據其所處微環境及其中細胞因子、生長因子，TLRs，信號通路(NF-κB、STATs、AP-1等)等不同，巨噬細胞可以極化為不同的表型[21]：經典活化型：M1和替代活化型：M2。M1/M2動態變化，反映機體免疫狀態，其極化方向在疾病的抗感染免疫和抗炎癥反應的病理生理過程中發揮重要作用，甚至直接影響疾病的結果。其中M1作用的延長或放大，M2防御的缺陷被認為是ALI發生發展的關鍵所在[21]。內毒素和INF-γ可使巨噬細胞極化為M1，在本實驗中大腸桿菌細胞壁上的脂多糖就起著極化M1的作用；M1主要表面標記物有：iNOS、IL-6、MHC-II。活化的M1吞噬病原體、凋亡細胞，釋放促炎因子TNFα、(IL)-1β、IL-6、 IL-12、 IL-15、 IL-23, 產生ROS、RNS、蛋白水解酶及生物活性脂，參與機體的炎癥應答[21]。在博來霉素、油酸、內毒素、二氧化硅誘導的急性肺損傷中，抗炎類固醇阻斷M1的促炎活性，可以減輕肺組織損傷[22-23]，可見過分活化的M1會導致肺組織損傷，發生ALI。但M1的生物活性作用可以被M2平衡。IL-4、IL-13可使肺巨噬細胞極化為M2。其主要表面標記物有：FIZZ1、 Arg1。M2主要發揮抗炎、組織修復及免疫調節作用, 通過增強抗炎因子IL-10、IL-1ra、IL-13及VEGF、EGF、PDGF表達，促進組織修復、重塑、血管生成，并保持穩態[21,24]。研究發現M2型巨噬細胞通過分泌抗炎因子IL-4、IL-10等在病毒性心肌炎、急性腎炎等的發病過程中起到了保護作用[25]；而暴露于吸煙、博來霉素、內毒素下的動物，肺組織中M2細胞數量增加，它們上調炎癥因子IL-4、IL-10、IL-13的表達，這些因子介導和刺激細胞外基質、生長因子的產生，促進組織的修復[22,26-27]。提示肺損傷的轉歸則很大程度上是由M2介導的。不過在急性肺損傷的早期，肺組織中巨噬細胞以M1為主[21]，細胞形態學改變及誘導iNOS及TNF-α的表達可以佐證。M2總是遲于M1的出現，如果可早期刺激M2的表達，逆轉M1/M2失衡，則可以減輕M1的作用，避免疾病的加重。結合上述雙氫青蒿素可以抑制炎癥通路，下調炎癥因子TNF-α、IL-1β等的表達，猜測雙氫青蒿素可能改變巨噬細胞所處微環境，從而影響巨噬細胞的極化。為此，本實驗將iNOS作為M1的表面標志物，IL-1β為M1的炎癥因子，血清及灌洗液TNF-α作為促炎因子；Arg1作為M2的表面標志物，IL-1ra為M2的炎癥因子，血清及灌洗液中IL-10作為抑炎因子。發現與Control組比較，E-coli組大鼠巨噬細胞表型以iNOS為主，IL-1β水平明顯升高，血清及灌洗液中炎癥因子以TNF-α為主；即ALI中巨噬細胞表型以M1為主。與E-coli組，雙氫青蒿素治療后，大鼠肺泡巨噬細胞表型以Arg1為主，IL-1ra水平明顯升高，血清及灌洗液中炎癥因子以IL-10為主。雙氫青蒿素治療改變了巨噬細胞的表型，使巨噬細胞表型向著促進疾病轉歸的方向發展。這可能與DHA的抗炎機制改變了ALI大鼠體內的炎癥水平及微環境有關。但雙氫青蒿素具體通過那種信號通路改變了巨噬細胞的極化，還需要進一步的研究來證明。

綜上，本實驗結果表明:1)、雙氫青蒿素灌胃治療可以減輕急性肺損傷炎癥；2)、雙氫青蒿素影響肺泡巨噬細胞的極化；雙氫青蒿素可能成為治療急性肺損傷的一種新方法。