中性粒細胞胞外誘捕網在中性粒細胞表型哮喘治療中的研究進展

姚文靜 萬瀅 李玲義 薛慶亮

哮喘(Asthma)是一種氣道慢性炎癥性肺疾病，其特征是氣道對過敏原的高反應性、可逆性氣流受限、氣道水腫和粘液分泌增加。哮喘根據誘導痰中浸潤的粒細胞不同，可分為四種不同的表型[1]，分別為嗜酸性粒細胞，中性粒細胞，混合性粒細胞和少粒粒細胞表型。中性粒細胞胞外誘捕網(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)是Brinkmann等[2]在2004年首次報道，當機體受到炎癥刺激時，中性粒細胞從血液中遷移到感染部位；它們通過吞噬、脫顆粒、NETs的形成釋放來有效地捕獲、殺滅病原微生物。盡管大多數嗜酸性粒細胞哮喘患者對糖皮質激素敏感[3]，但中性粒細胞表型哮喘對糖皮質激素療效欠佳。中性粒細胞表型哮喘的患者氣道中形成了NETs，NETs在中性粒細胞表型哮喘中可能促進了疾病的發生發展，對治療產生一定的影響。本文就針對NETs在中性粒細胞表型哮喘治療中的作用進行綜述。

NETs的形成、形成過程及降解

一、NETs的形成及結構

NETs的形成被認為是宿主防御入侵病原微生物的機制之一；當生物體被感染產生炎癥時，中性粒細胞被激活并釋放形成NETs。細菌感染部位的NETs形成釋放，被認為是中性粒細胞的非經典功能。多項研究表明，白介素-8(IL-8)[4]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]、脂多糖(LPS)[6]、佛波酯(PMA)、尿酸單鈉(MSU)晶體、細胞因子等可誘導中性粒細胞的活化。隨后，活化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)產生大量的活性氧(ROS)，這些ROS通過與toll樣受體4(TLR4受體)結合從而導致中性粒細胞核膜的裂變。此外，細胞內中性粒細胞彈力蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(MPO)通過中性粒細胞核膜的分裂遷移到細胞核，它們在細胞核內降解組蛋白并促進染色質的去濃縮[7]。并且，肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(PAD4)誘導的組蛋白的瓜氨酸化進一步促進了染色質的去濃縮[8]。有研究報道鈣結合可能參與了PAD4的活化，而ROS可能參與調節了PAD4的活化[9]。染色質去濃縮后，DNA釋放與顆粒狀細胞質和各種蛋白混合，然后主動地排出到細胞外空間，形成了NETs。NETs是由細胞外的DNA、組蛋白和顆粒蛋白組成[5]，其中DNA為NETs的主要結構，并且顆粒蛋白包括NE、MPO、組織蛋白酶G(CG)、乳鐵蛋白、蛋白酶3(PR3)、溶菌酶和鈣衛蛋白等。NETs結構的完整性為其功能提供了基礎。

二、NETs的降解

Farrera 等[10]報道了單核細胞衍生的巨噬細胞能夠有效清除中性粒細胞擠出的NETs。巨噬細胞對NETs的快速清除可以防止產生針對DNA或NETs其他成分的自身免疫反應。巨噬細胞對NETs的清除不足可能會導致自身免疫性疾病。Frese[11]提出DNA酶I(DNase I)存在于血液中，通過降解NETs的主要結構DNA從而預防狼瘡性腎炎的發展。DNase I的酶活性取決于陽離子環境，在Mg2+和Ca2+存在的環境中，該酶可以切割DNA雙螺旋中的單鏈。

NETs的生物學作用

一、NETs的抗微生物作用

NETs已被證明可捕獲和殺死革蘭氏陽性細菌，革蘭氏陰性細菌，真菌，寄生蟲和原生生物。中性粒細胞通過釋放NETs來捕獲限制那些因太大難以被吞噬的細菌如酵母菌和單個的細菌[12]。NETs捕獲和殺死病原微生物可能與其組分相關，其中NE可以通過切割病原微生物的毒力因子并防止其從吞噬溶酶體中逸出來，以此來滅活和殺死病原微生物；組蛋白可以分解病原微生物細胞膜，并限制微生物的生長；MPO的活性對于消滅金黃色葡萄球菌至關重要[13]，它也可以催化形成具有殺菌作用的次氯酸鹽；鈣衛蛋白是胞質蛋白S100A家族的成員，它通過螯合二價金屬離子鋅來抑制真菌的生長，因為鋅是真菌生長所需的陽離子[7]；微生物捕獲過程的發生是通過基于帶正電荷的細菌表面與帶負電荷的染色質纖維之間的靜電相互作用來完成的[14]。

二、NETs的免疫作用

NETs形成與自身免疫性疾病的相關性首先在ANCA相關的血管炎中證實，隨后在其他自身免疫性疾病中描述，包括銀屑病、系統性紅斑狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎(RA)[15-16]。NETs中的顆粒蛋白可能是自身抗原的來源，其中包括ANCA相關血管炎中的MPO，SLE中的dsDNA抗體和RA中的抗環瓜氨酸肽抗體(ACPA)[17]。NETs的顆粒蛋白不僅充當免疫復合物形成和自身抗體的靶標，而且還進一步誘導NETs形成。NETs還可以通過產生I型干擾素和激活補體系統的經典途徑和代替途徑來促進自身免疫。在銀屑病和SLE中，NETs的細胞外DNA能夠誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)產生干擾素-α(IFN-α)[18]。 pDC是IFN-α的主要生產者，通常是對入侵病毒做出反應的。具有dsDNA核含量的NETs同樣可以通過pDC來誘導IFN-α的產生。然后，IFN-α可以激活先天和適應性免疫系統，特別是誘導Th 1型通路，抑制T細胞凋亡，激活B細胞和抗體產生[19]。

三、NETs的不良反應

①促進痰液粘稠：肺囊性纖維化(CF)患者的痰液含有豐富的NETs，這導致CF患者難以咳出粘稠的痰液。當給予CF患者DNase治療時，CF患者痰液變得稀薄，較易咳出，可能與DNase可以降解NETs中的DNA結構有關[20]，從而達到治療CF。②過度反應：盡管NETs具有抗微生物的特性，但在某些情況下，NETs的過量存在或無法被DNase降解時可能對宿主有害，因此，NETs被認為是“先天免疫的雙刃劍” 。NETs的成分，例如細胞外DNA、組蛋白和NE具有促炎作用，并且會促進疾病發生與進展[21]。③促血栓作用：Fuchs等[22]首次報道了NETs的促血栓作用。該研究表明，NETs可以捕獲血小板，促進其活化和聚集。NETs還被證明可以通過為紅細胞和促凝血因子提供支架來促進凝血酶的形成，例如血管性血友病因子(VWF)、纖維蛋白原、XII因子(FXII)和組織因子(TF)。NETs的組蛋白-DNA主鏈被認為可以增加血栓中纖維蛋白支架的穩定性[23]。在組蛋白-DNA復合物存在的情況下，纖維蛋白原凝塊會導致纖維蛋白的纖維變粗，增加纖維蛋白凝塊的穩定性以及顯著延長凝塊的溶解時間[24]。

NETs在中性粒細胞表型哮喘治療中的研究進展

一、NETs在中性粒細胞表型哮喘發生發展中的作用

①直接的炎癥反應：有報告表明[25]，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞可以在哮喘患者氣道中產生細胞外DNA誘捕網。并且在患有哮喘的患者支氣管活檢中檢測到了NETs和嗜酸性粒細胞外誘捕網(EETs)的形成[26]。與非中性粒細胞人群相比[27]，中性粒細胞表型哮喘患者的誘導痰中NETs及其組分有所增加，即細胞外DNA、抗菌肽LL-37和CXC趨化因子配體8(CXCL8)/ IL-8明顯升高。Marrah E通過實驗證明[28]，哮喘患者痰液中的細胞外DNA與氣道中性粒細胞炎癥相關，這與肺功能和哮喘的有效控制呈負相關。一項新的研究表明[29]，NETs可以通過破壞氣道上皮并引發炎癥反應，從而加劇中性粒細胞表型哮喘的嚴重程度。已經發現中性粒細胞表型哮喘患者的LPS水平升高，表明NETs可能與LPS的存在有關；此外，IL-8可能是這些氣道發生NETs的潛在誘因，因為先前在其他研究中已經證明它會誘發NETs形成[30]。在中性粒細胞表型哮喘患者的氣道中，活化的中性粒細胞產生的NETs可能增強對感染的抵抗。中性粒細胞表型哮喘患者的肺部中性粒細胞浸潤明顯。研究表明[31]，中性粒細胞通過誘導粘液分泌過多和氣道重塑在中性粒細胞表型哮喘惡化中起著至關重要的作用，這分別可導致急性可逆性和進行性不可逆性氣道阻塞。②免疫損傷：NETs的增加會加重中性粒細胞表型哮喘患者的癥狀；在中性粒細胞表型哮喘患者中，肺泡巨噬細胞降解NETs的能力受到損害[10]，從而導致中性粒細胞表型哮喘持續存在。以上提示氣道中的NETs促進了中性粒細胞表型哮喘發生發展。

二、重組人DNA酶(rhDNase)在哮喘治療中的作用

中性粒細胞表型哮喘患者通常表現出嚴重的癥狀[32-33]，對傳統的糖皮質激素治療無反應。此外中性粒細胞表型哮喘患者服用糖皮質激素治療后可加劇肺部炎癥，因為糖皮質激素可以延長中性粒細胞的生存期[34]。da Cunha通過實驗證明[35]，重組人DNase(rhDNase)可以降解哮喘小鼠模型的細胞外DNA誘捕網，并降低氣道阻力及改善肺功能。他通過在第0 d和第7 d給予小鼠兩次皮下注射卵清蛋白(OVA)致敏，然后在第14 d，第15 d和第16 d給予OVA鼻內攻擊3次。對照組使用磷酸鹽緩沖液(DPBS)代替OVA，從而建立哮喘小鼠模型，在第15 d和16 d時，給予OVA攻擊2 h后小鼠接受1 mg/mL的鼻內rhDNase；從而得出，鼻涕中的細胞外DNA在哮喘小鼠模型的下氣道阻塞中起到一定的作用，當給予rhDNase治療，可減少細胞外DNA誘捕網的形成，并顯著的降低下氣道阻力。在個案報道[36]，針對急性嚴重性哮喘的患者，給予rhDNase和吸入糖皮質激素聯合治療，可以降低痰液的黏稠性，并改善肺通氣。

總結與展望

NETs是一把“雙刃劍”，既可以起到捕獲病原體、殺菌等作用，也可啟動免疫應答對機體造成損傷。NETs產生過多或降解減少，都可以引起免疫性疾病的發生和進展。然而，目前為止NETs形成及降解的機制尚不明確，在疾病中的發病機制有待進一步的研究。NETs在中性粒細胞表型哮喘可能促進了疾病發生與進展的作用。rhDNase的治療為哮喘的患者帶來了曙光。