醫用生物蛋白膠對電灼傷致創傷性局灶性胰腺炎的保護作用

黃建明，錢雷敏，仲衛冬，錢建忠， 花 晨， 張 婷， 陳海姣

創傷性局灶性胰腺炎（post-traumatic focal pancreatitis， PTFP）為一種特殊類型的胰腺炎，臨床表現為血淀粉酶較低，腹水淀粉酶顯著升高，胰腺本身炎癥較輕，胰周組織炎癥水腫，常有包裹性積液及粘連，可有局限性皂性壞死，如不加干預，大部分患者可自愈，但少數患者可并發粘連性腸梗阻、腹腔出血、消化道瘺等重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）。 目前臨床針對PTFP 尚無確切有效的治療方法。 因此，尋找有效的治療方法對提高PTFP 患者治愈率、減少嚴重并發癥甚至死亡發生率至關重要。

醫用生物蛋白膠在國內外被廣泛應用于外科手術中。 除發揮封閉組織缺損的物理作用，其還可通過新生血管形成或作為多種生長因子、前體細胞媒介促進創傷愈合。 本研究在建立大鼠PTFP 模型基礎上，觀察醫用生物蛋白膠對大鼠PTFP 不同時間點胰腺細胞及胰周組織的影響，為臨床PTFP 的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及處理 清潔級SD 大鼠（由南通大學動物實驗中心提供）30 只，體質量范圍200 ～250 g，雄雌不限。 將大鼠隨機分為對照組和治療組，各15 只。

1.2 手術步驟 手術前12 h 禁食水，備皮，麻醉采用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）經腹腔注射。 麻醉成功后，消毒，剖腹并解剖出胰腺組織，使用高頻電刀（CONMED SYSTEM 5000，模式:bipolar，功率:5 Ω）電凝胰腺被膜，選取胰腺組織較為集中區域（胃后方近脾門），灼傷面積約1 cm×1 cm。 電灼傷后治療組胰腺創面涂布生物蛋白膠（產品名稱:豬源纖維蛋白粘合劑；規格:2.5 ml；生產廠家:杭州普濟醫藥技術開發有限公司），胰腺復位后關腹；對照組則用生理鹽水涂布胰腺創面。 術中注意補液，采用生理鹽水2 ml/100 g 皮下注射。 術后注意保暖，使用棉布包裹大鼠。 取材:在術后24、72 h 和7 d 3 個時間點進行解剖，每組每個時間點5 只大鼠，提取血清、腹水及胰腺組織并合理保存標本。

1.3 觀察指標 （1）手術過程中觀察試驗動物的一般狀況，監測術后精神狀態、活動、進食、排便的變化。（2）剖腹大體觀察腹腔情況，包括腹水量。 （3）Elisa法檢測血清、腹水磷脂酶A2（PLA2）以及腹水中腫瘤壞死因子（TNF-α）水平。 （4）免疫組織化學染色及Western Blot 檢測胰腺組織PLA2 蛋白、自噬相關蛋白LC3、Beclin1 和調控分子空泡膜蛋白1（VMP1）、磷脂酰肌醇三磷酸激酶（PI3K）、NF-κB 等表達情況。

1.4 統計學處理 用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，數據以均數±標準差表示，計量資料使用t 檢驗；計數資料使用卡方檢驗。 P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況 2 組大鼠術后2 h 均精神萎靡，被動體位，僅頭部有間斷探索樣運動，對飲食刺激無反應。 治療組大鼠術后24 h 后均開始自由活動，主動進食，攝食量逐漸增加，在觀察點72 h 少數大鼠腹脹，均有排便行為，在3 個時相點均無大鼠死亡；對照組大鼠術后24 h 僅5 只開始活動及進食，活動遲緩，攝食少，在觀察點72 h 均主動進食，大部分大鼠腹脹，有排便行為僅2 只，在觀察點7 d，5 只大鼠攝食量增加，腹脹減輕，均有排便行為，但量少，同樣在3 個時相點均無大鼠死亡。

2.2 大體變化結果 術后24 h，2 組均有血性腹水形成，對照組明顯多于治療組；大鼠胃均有擴張，對照組胃壁及十二指腸系膜水腫明顯；對照組胰腺周圍的脂肪組織出現灰白色的脂肪壞死斑點，治療組則較少；胰腺腫脹，呈粉紅色，均散布細小出血壞死灶，治療組較明顯。 術后72 h，治療組大鼠胰腺呈淡紅色，輕度腫脹，創面面積縮小，與周圍脂肪組織界限清晰，腹腔內液體為淡黃色，且明顯減少；對照組大鼠胰腺呈暗紅色，明顯腫脹，創面無明顯縮小，腹腔內有較多暗紅色半透明滲出液。 術后7 d，2 組腹水量均較少；對照組胰腺與周圍組織界限不清，腸粘連致密，腸壁水腫；治療組胰腺與周圍組織界限清楚，易分離，腸粘連不明顯，胰腺呈粉紅色，創面幾乎消失。 結果見表1 和圖1。

表1 對照組和治療組大鼠術后不同時間腹水量比較（ml

表1 對照組和治療組大鼠術后不同時間腹水量比較（ml

注:與對照組比較aP ＜0.05

組別 動物數 24 h 72 h 7 d對照組 5 4.84 ±0.27 1.58 ±0.58 0.78 ±0.19治療組 5 2.26 ±0.18a 1.50 ±0.39 0.46 ±0.09a

2.3 胰腺組織鏡下病理變化 光鏡下，術后24 h，胰腺腺泡結構改變:淺層胰腺腺泡、間質均有充血水腫、凝固性壞死，核碎裂，核溶解等，可觀察到電灼傷所致的物理性損傷改變，可見較多充血壞死灶，以中性粒細胞為主的炎性細胞向壞死灶浸潤，治療組較對照組明顯；術后72 h，胰腺腫脹減輕，充血壞死灶少，壞死區炎性細胞浸潤減少，治療組較對照組明顯；術后7 d，呈慢性炎癥改變，充血壞死灶少見，以淋巴細胞浸潤為主，見較多組織細胞，間質內纖維細胞增多，治療組較對照組明顯。 見圖2。

2.4 血清和腹水PLA2 水平、腹水炎癥因子TNF-α水平 在3 個時相點治療組腹水PLA2 及TNF-α 水平均低于對照組（P ＜0.05）。 見圖3。

2.5 免疫組織化學染色檢測不同時相點胰腺組織PLA2 和自噬相關蛋白及調控蛋白 免疫組織化學染色結果顯示: PLA2 和自噬相關蛋白（LC3、Beclin1）及調控蛋白（VMP1、PI3K 和NF-кB）在胰腺組織中的表達部位相似，主要位于胰腺腺泡細胞胞漿內。 此外，由于創傷后胰腺腺泡細胞的大量破壞，胞漿中的酶釋放到細胞外，腺泡細胞外的導管、纖維組織均可見PLA2 的高表達，而2 組腺泡細胞內表達強度均較低。 除VMP1 在3 個時相點的表達對照組均高于治療組外，其他蛋白在術后24 h 和72 h 的表達強度2 組之間有特征性差異，表現為術后24 h 治療組胰腺細胞內蛋白表達強度高于對照組；但術后72 h 則對照組高于治療組，且治療組術后72 h 表達強度下降，對照組則增強，隨之，表達強度均下降；術后7 d 2 組表達均呈弱陽性，但對照組的表達強度略高。 見圖4 ～9。

2.6 Western Blot 分析不同時間點胰腺組織中PLA2 和自噬相關蛋白及調控蛋白的表達變化 Western Blot 結果與免疫組織化學染色結果趨勢基本一致。 術后24 h，治療組PLA2 和自噬相關蛋白（LC3 和Beclin1）及調控蛋白（VMP1、PI3K 和NFкB）的表達高于對照組；但術后72 h，對照組上述蛋白的表達量高于治療組，治療組蛋白的表達呈下降趨勢，隨后2 組蛋白的表達量均下降；至術后7 d，對照組的蛋白表達量仍高于治療組。 見圖10。

3 討論

胰腺炎發生時，大量病理性激活的胰酶（包括胰蛋白酶、彈力蛋白酶、脂肪酶及PLA2 等）進入血循環中，產生破壞作用。 其中，PLA2 被激活后，作用于細胞膜和線粒體膜的甘油磷脂，分解其卵磷脂和腦磷脂中的脂肪酸分子為溶血卵磷脂，后者具有高度的細胞毒性，可以溶解破壞胰腺及體內各組織細胞膜和線粒體膜的脂蛋白結構，使細胞壞死，引起胰腺和胰周組織進一步廣泛壞死。 此外，PLA2 還可觸發體內的單核巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等釋放大量內源性炎性介質，導致機體發生全身的炎癥反應（SIRS）［1］。 這些都是胰腺炎患者發生并發癥和導致死亡的主要原因［2-3］。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現象，主要通過對長壽命蛋白以及細胞器的降解和再利用對細胞進行調節。 研究表明，自噬是細胞生長發育、成熟分化及死亡的重要調控機制，又是細胞對不良環境的一種防御機制［4-5］。 除此之外，自噬參與多種疾病的病理過程，如腫瘤、神經退行性病變、心臟疾病、病原體感染等［6］。 隨著對細胞自噬的分子機制的深入研究，其在疾病中的作用引起了學者廣泛的重視。 最近的研究表明自噬活性的異常改變與急性胰腺炎關系密切［7-9］，已成為目前探討急性胰腺炎發生發展研究的新靶點。

圖1 手術后大鼠胰腺及胰周組織大體改變

圖2 光鏡下大鼠胰腺組織病理變化（HE 染色 ×40）

圖3 大鼠血清（A）、腹水PLA2（B）和腹水TNF-α（C）的檢測情況（C：對照組；G：治療組）

注:PLA2 為磷酯酶A2

圖5 大鼠胰腺組織自噬相關蛋白表達情況（DAB 染色 ×100）

圖6 大鼠胰腺組織Beclin1 表達情況（DAB 染色 ×100）

圖7 大鼠胰腺組織空泡膜蛋白1表達情況（DAB 染色 ×100）

圖8 大鼠胰腺組織磷酯酰肌醇三磷酸激酶表達情況（DAB 染色 ×100）

圖9 大鼠胰腺組織核因子-кB 表達情況（DAB 染色 ×100）

圖10 大鼠胰腺組織PLA2 及LC3 的表達情況（Western Blot）

本研究提示，電灼傷致創傷性局灶性胰腺炎大鼠模型的血清PLA2 表達早期開始增高，隨著術后時間的延長而繼續增加，術后24 h 血清PLA2 表達維持于較高值。 創傷后7 d，血清PLA2 表達較前期下降，但仍顯著高于對照組。 這些結果證實，胰腺創傷后早期主要受到電熱傷的物理性損傷，淺層的胰腺腺泡被破壞，胞漿中的酶大量釋放到細胞外，隨后化學性損傷加重胰腺炎，但深部胰腺組織結構正常，故創傷性局灶性胰腺炎不至于導致血清PLA2 明顯升高，血清中PLA2 與正常大鼠無明顯差異，這與臨床上出現創傷性局灶性胰腺炎后血清淀粉酶升高不明顯一致，此不同于膽源性重癥胰腺炎表現，但導致胰周腹水中PLA2 水平早期明顯增加，且峰值時間在傷后72 h 出現并可以維持較長時間。 隨著胰腺組織的自我修復，傷后7 d 腹水中PLA2 水平有所下降，但仍較高。 本研究通過自噬相關基因及蛋白的檢測同樣發現在創傷性局灶性胰腺炎術后24 h 自噬現象即明顯存在，在術后72 h 達高峰，仍持續增多，隨著胰腺組織的自我修復及慢性炎癥的形成逐漸減弱，但胰腺周圍組織的病理性損傷仍明顯，早期滲出、出血、壞死明顯，后期粘連顯著。 因此在創傷性局灶性胰腺炎發生后如何保護胰腺及胰周組織是值得研究的課題。

臨床已發現胃癌根治術中應用醫用生物蛋白膠涂布胰腺表面可減少腹水、腹腔出血及粘連，但對胰腺本身有無影響，無法判斷。 因此本研究在創傷性局灶性胰腺炎大鼠模型構建成功的基礎上，進一步研究了使用生物蛋白膠后胰腺及胰周組織變化情況。

研究發現，生物蛋白膠在24 h 內并沒有對胰腺組織本身發揮有利作用，僅作為隔絕炎性滲出的物理屏障。 由于胰腺腺泡細胞被大量破壞，細胞漿內的大量酶因蛋白膠的阻擋而無法彌散稀釋，大量消化酶發生自我消化，可導致接近壞死區深部的胰腺腺泡被破壞，但由于局灶性壞死緣故，不至于并發重癥胰腺炎。因此在鏡下觀察胰腺局灶壞死區早期有大量炎性細胞浸潤，但炎性滲出帶較輕，自噬相關的調控蛋白VMP1、PI3K 及NF-κB 上調活化參與早期自噬激活的過程。 72 h 后，治療組電灼創面縮小，胰腺組織病理改變好轉，PLA2、自噬相關蛋白表達下調，生物蛋白膠后期又發揮促進胰腺組織修復的功能，其中的機制尚不明確，可能與生物蛋白膠可促進新生血管形成或作為多種生長因子、前體細胞媒介促進創傷愈合有關［10-12］。

綜上，醫用生物蛋白膠全程對胰腺周圍組織具有保護作用，早期對胰腺起到隔絕創傷性局灶性胰腺炎的物理作用，后期發揮生物活性對胰腺創面進行修復。