杞菊湯對PM2.5致急性肺損傷小鼠的預防作用

徐淑琴 楊珺超 劉翠清 陳如程 王真 洪輝華

近年來隨著社會經濟的不斷發展，霧霾天頻發，給人類的生活和身心健康造成了嚴重的影響。近20年的流行病學資料表明，大氣污染與呼吸系統疾病的住院人數和死亡率存在著正相關的關系［1］。本實驗模擬春秋之季大氣污染環境，自擬杞菊湯對PM2.5 致小鼠急性肺損傷進行預防性干預治療，探討杞菊湯預防PM2.5 所致小鼠急性肺損傷的療效，以期為中醫藥預防此類疾病提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性ICR 小鼠44 只，體重（25±5）g，由浙江中醫藥大學動物實驗研究中心提供。實驗時間2019 年9 月至10 月。

1.2 實驗藥品制備 杞菊湯由枸杞子、杭白菊、馬齒莧等組成，藥品由浙江省中醫院中藥房提供，由浙江中醫藥大學制劑中心制備成含生藥0.713g/ml 的中藥濃縮藥液。將乙酰半胱氨酸制成0.0091g/ml 的乙酰半胱氨酸溶液，藥品由浙江省中醫院西藥房提供。

1.3 實驗試劑與儀器 小鼠TNF-α ELISA 試劑盒（70-EK282HS，聯科），小鼠IL-1β ELISA 試劑盒（70-EK201BHS，聯科），小鼠IL-6 ELISA 試劑盒（70-EK206HS，聯科），MDA 試劑盒（A003-1，南京建成），GSH-PX 試劑盒（A005，南京建成），205 暴露倉（山東巨康空氣凈化科技有限公司定制CAPS-3），TGL-16 型臺式高速離心機，5810R 型臺式高速冷凍離心機，DKB-454A 型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司），DGG-9240A 型電熱恒溫箱，752型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），Bio-Tek ELX800 全自動酶標儀，-80℃低溫冰箱（美國Thermo），微量移液器（京君龍實驗儀器北京有限公司）。

1.4 動物模型的建立與處理 （1）動物分組：44 只雄性ICR 小鼠隨機分成4 組，分別為正常組、模型組、乙酰半胱氨酸組和中藥組，每組各11 只。（2）染毒方法：在小鼠染毒造模前1 天對205 暴露倉各項參數進行調試，維持暴露倉中PM2.5 濃度的濃縮倍數為6~10倍，溫度波動范圍為20~25℃，于造模當日將模型組、乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠放入205 暴露倉內，每日持續染毒10~12h，并通過暴露倉中PM2.5 實時檢測系統對其濃度進行監測。（3）實驗給藥和造模：各組小鼠在正常環境下適應性飼養2 周，于實驗第1 天起，正常組、模型組小鼠灌服0.9%生理鹽水0.01ml/（g·d），乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠分別灌服乙酰半胱氨酸溶液和杞菊湯0.01ml/（g·d），連續灌服7d。第8 天起，正常組小鼠放入潔凈倉中，連續放入3d，另外三組小鼠放入205 暴露倉中開始染毒，連續染毒3d，10~12h/d。

1.5 觀察指標及方法 （1）一般情況：觀察小鼠精神和活動狀態，毛發光澤度，飲食二便和死亡情況，每日稱量并記錄小鼠體重；各組小鼠染毒造模期間，每日定時記錄暴露倉中PM2.5 的濃度。（2）血清收集：采取摘眼球法收集小鼠外周血，用離心機在4℃、3000r/min 條件下離心10min，取上層血清，置于-80℃冰箱保存備用。（3）指標檢測：用ELISA 法檢測小鼠血清中TNF-α 的濃度，用生化法檢測小鼠血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的含量，具體操作方法按試劑盒說明書進行。（4）肺組織病理學觀察：摘取小鼠右側肺臟置于福爾馬林溶液中浸泡、固定，24h 后石蠟包埋，制作成5μm 厚的切片，脫蠟后，對標本進行蘇木素-伊紅（HE）染色，最后于光鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件。計量資料以（±s）表示。多組間均數比較，若方差齊，使用單因素方差分析，兩兩比較用LSD 法；若方差不齊，使用秩和檢驗，兩兩比較用獨立樣本kruskal-wallis 檢驗中的成對比較法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 灌胃期間各組小鼠精神狀態良好，活動靈敏，毛發光澤度佳，飲食二便正常，呼吸平穩，體重自然緩慢增長。模型組小鼠放入染毒倉暴露3d 后，精神萎靡，活動減少，毛發光澤度下降，飲食量相對減少，呼吸稍顯急促。乙酰半胱氨酸組小鼠放入染毒倉暴露3d 后精神狀態一般，活動較正常組小鼠稍有減少，毛發光澤度一般，進食量與正常組小鼠相差不大，呼吸運動較模型組小鼠平穩。中藥組小鼠放入染毒倉暴露3d 后精神狀態尚可，喜靜，毛發略有光澤，飲食量無明顯變化，呼吸運動基本正常；實驗期間中藥組因灌胃操作不當死亡小鼠1 只；小鼠染毒造模期間205 暴露倉中3d 平均PM2.5 濃度分別為209.8μg/m3、140.2μg/m3、225.5μg/m3。

2.2 肺組織病理學改變 正常組小鼠肺組織未見明顯病理學變化（見圖1）；模型組小鼠肺組織可見肺泡間隔斷裂，多個肺泡融合成肺大泡，肺泡腔內可見有淡粉色液體滲出，部分小支氣管、肺毛細血管黏膜出現損傷，肺間質、肺泡腔內及支氣管周圍可見大量的炎性細胞浸潤（見圖2）；乙酰半胱氨酸組和中藥組小鼠可見肺組織炎性改變減輕，部分區域重現完整結構、分布均勻的肺泡，肺泡腔內滲出液相對減少，肺泡間隔有所變薄，部分損傷的支氣管、肺毛細血管管壁黏膜有所修復，肺間質、肺泡、支氣管及肺毛細血管周圍炎性細胞浸潤減少（見圖3、圖4）。

圖1 正常組小鼠肺組織

圖2 模型組小鼠肺組織

圖3 乙酰半胱氨酸小鼠肺組織

圖4 中藥小鼠肺組織

2.3 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX 表達比較 （1）各組小鼠血清中TNF-α 濃度比較：與正常組比較，模型組TNF-α 濃度顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組TNF-α 濃度顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01），中藥組TNF-α 濃度下降，差異有統計學意義（P<0.05）；乙酰半胱氨酸組與中藥組TNF-α 濃度差異無統計學意義。（2）各組小鼠血清中MDA 含量比較：與正常組比較，模型組MDA 的含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組MDA 的含量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01），中藥組MDA 含量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）；乙酰半胱氨酸組與中藥組MDA 的含量差異無統計學意義。（3）各組小鼠血清中GSH-PX含量比較：與正常組比較，模型組GSH-PX 的含量顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，乙酰半胱氨酸組GSH-PX 的含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01），中藥組GSH-PX 的含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；乙酰半胱氨酸組與中藥組GSH-PX 的含量差異無統計學意義（見表1）。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表達（±s）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、MDA、GSH-PX的表達（±s）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.01

組別 只 TNF-α（pg/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX（u）正常組 6 5.70±1.63 3.50±0.74 436.85±23.55模型組 6 9.98±2.16# 6.71±1.31# 338.06±28.01#乙酰半胱氨酸組 6 7.07±1.28** 4.86±1.08** 415.52±36.25**中藥組 5 8.15±1.38* 5.16±0.79** 389.53±25.20**

3 討論

大氣污染對人體的慢性毒害不容忽視，西醫學對此類疾病的治療注重防護為主，如霧霾天出門佩戴口罩，居家關閉門窗，在室內擺放綠色植物等，中醫學常根據患者的癥狀、年齡、體質和發病時節的不同，隨證治之，相關研究發現大多經典方可緩解PM2.5 對呼吸系統造成的損害，如朱雪等［2］選用煤煙相關顆粒物建立肺損傷小鼠模型，玉屏風散的預防性使用可提高小鼠細胞免疫以及體液免疫功能；師燕飛［3］選用煙熏染毒法建立肺損傷小鼠模型，實驗結果顯示血府逐瘀湯的干預可改善氣道炎癥反應和氧自由基代謝紊亂，且可提高細胞免疫功能。許寧等［4］通過氣管滴注PM2.5 混懸液法建立肺損傷大鼠模型，實驗研究發現連花清瘟可以拮抗大鼠肺部的炎性損傷。本實驗采用霧化吸入法對小鼠進行PM2.5 染毒，結果提示PM2.5的急性暴露可引起小鼠急性肺損傷，杞菊湯可通過減輕炎癥反應，抑制氧化應激預防PM2.5 對小鼠肺組織造成的損害。

本實驗采用205 暴露倉更符合模擬人類在春秋之季遭受自然環境中PM2.5 毒害的過程，本次實驗小鼠染毒時長為10~12h，從早上8 點或10 點染毒至晚上8點，也符合人類日常作息規律；霧霾易耗傷人體津液，肺失濡養，可致口鼻咽干、干咳少痰，杞菊湯可潤肺生津，利咽止咳；PM2.5 所攜帶的有毒物質可在肺部日積月累，不易被人體所排泄，且外來之邪可影響人體氣血津液的運行，使人出現咳痰，咯血，喘滿，胸悶等癥，杞菊湯可疏散外邪，清解內毒。現代藥理學研究證明杞菊湯中所含的中藥均富含大量的維生素和類胡蘿卜素［5-8］，國內外研究發現，類胡蘿卜素、維生素B、維生素C、維生素D、維生素E 可拮抗PM2.5對人體呼吸系統造成的損傷［9-10］。

本實驗僅對炎性細胞因子和氧化/抗氧化系統的標志性物質進行檢測，將來可對杞菊湯預防PM2.5 致急性肺損傷的具體作用機制進一步研究。