Hp感染根除治療前后慢性胃炎胃黏膜組織中miR-22和NLRP3炎癥小體表達水平變化

陳夢娜 李善高

幽門螺桿菌（Hp）是一種嚴重影響公眾健康的革蘭氏陰性微需氧致病菌，可引起慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃黏膜相關組織淋巴瘤等胃部疾病［1］。1994 年，國際癌癥研究機構（IARC）將Hp 定義為胃癌I 類致病物［2］。我國目前Hp 感染率達50%，含鉍劑四聯已作為經驗性根除治療Hp 方案，隨著多種抗生素的耐藥率增高，Hp 感染根除殺菌已成為臨床治療的巨大挑戰。本研究通過測定不同Hp 感染程度的慢性胃炎患者殺菌前后的胃黏膜組織中miR-22 和NLRP3 炎癥小體表達水平變化，初步探討miR-22 及NLRP3 炎癥小體信號通路在Hp 感染致病中的作用，旨在為Hp 相關性疾病的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月至2019 年3 月浙江中醫藥大學附屬第一醫院內鏡中心Hp 感染陽性及同期Hp陰性慢性胃炎患者105例，其中陽性組患者85例，男49 例，女36 例，年齡20~60 歲。根據感染程度分為輕度感染組18 例、中度感染組22 例、重度感染組45 例。陰性組患者20 例，男11 例，女9 例，年齡20~60 歲。納入標準：（1）陽性組患者，C14-尿素呼氣試驗及胃黏膜組織切片HE 染色結果均為陽性；（2）近期血液有關指標如血常規、肝腎功能及凝血類等均無明顯異常；（3）未曾有Hp 根除治療；（4）意識清楚，無認知障礙等。排除標準：（1）近1 個月內使用抗生素、PPI、非甾體類藥物、大劑量激素、免疫抑制劑等人群；（2）排除有嚴重藥物過敏史、孕婦、哺乳期婦女、藥癮者、酗酒者等；（3）排除嚴重消化性潰瘍、胃大部切除史、胃腸道惡性腫瘤等消化道疾患者，嚴重心、腦、肝、腎功能不全，嚴重風濕免疫系統疾病，內分泌系統疾病，血液系統疾病，神經精神性疾病等。本項目經浙江中醫藥大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）14C-尿素呼氣試驗：患者保持清晨空腹，檢測前漱口，而后通過溫涼飲用水（20ml）服用1 粒尿素C14 膠囊（藥物由深圳中核海得威生物公司提供）。靜坐15~20min 左右，將呼氣卡取出，沿呼氣口向卡內進行1~3min 的呼氣，期間允許換氣，忌吸氣，直至卡上指示窗的顏色由橙紅色變成黃色為止。將呼氣卡檢測窗口上的封簽揭去，插入HUBT-20 型幽門螺桿菌測試儀中，待儀器自動對標本進行檢測，結果以每分鐘衰變數（DPM/mmol）表示。評判標準：陰性：DPM<100；陽性：DPM ≥100。（2）胃黏膜組織標本采集：所有研究對象均行常規胃鏡檢查，臨床醫師在胃鏡下使用相同批次的活檢鉗鉗取胃竇部位的胃黏膜組織標本至少2 塊，每塊標本大小約0.2cm×0.2cm，其中1 塊胃黏膜組織標本置于10%福爾馬林中固定，另1 塊胃黏膜組織標本立即于-80℃冰箱內冷藏備用。（3）HE 染色：取出在10%福爾馬林中固定后的胃黏膜組織，沖洗干凈后依次放入低濃度和高濃度的乙醇進行脫水處理，加入二甲苯進行透明處理，使其充分替換出殘留在其中的乙醇。后將標本放入石蠟塊中包埋，用切片機切成厚度約為4μm的薄片，再次加入二甲苯中脫蠟處理，依次放入高濃度和低濃度的乙醇，最后經蒸餾水處理1 次。在處理好的切片中加入蘇木精染色溶液染色15min，并在鹽酸和氨水中各分色幾秒，用蒸餾水沖洗干凈后加入伊紅酒精溶液染色處理3min，將染色后的切片分別使用100%乙醇和二甲苯進行脫水透明處理，并在切片上加入中性樹膠，放上蓋玻片進行封固，放置于烤箱內將其烘干，使用電子顯微鏡觀察胃黏膜組織病理形態改變，并拍照保存，貼上標簽以備待查。通過在高倍顯微鏡下對胃黏膜的黏液層及上皮組織進行觀察，對Hp感染程度進行分組，評判標準［3］：切片上未見Hp 菌體表示無Hp 感染；見菌株分布<1/3 標本全長表示輕度Hp 感染（+）；>1/3 標本全長，不>2/3 區域表示中度Hp 感染（++）；Hp 菌株成堆存在，基本分布于標本全長表示重度Hp 感染（+++）。（4）RT-PCR 檢測miR-22，NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）、凋亡相關斑點蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）mRNA 表達水平：將置于-80℃冰箱冷藏的胃黏膜組織取出，Trizol 法提取總RNA，取總RNA 1μg，以細胞總RNA 為模板，逆轉錄cDNA，制成20μl 逆轉錄體系；以1.0μl DNA 作為底物進行Real-time PCR：在96X PCR 板各空中加入1.0μl cDNA、5xSYBR mix以及目的條帶引物，總反應體系為20ul，置于熒光定量PCR 儀中。95℃5min 預變性后，95℃ 15s →63℃ 25s（收集熒光），40cycles，之后進行溶解曲線實驗，檢測是否含有非特異性條帶擴增。各個基因的相對表達水平以2（Ct 內參基因－Ct 目的基因）進行統計分析。RT-PCR 引物序列見表1。（5）Western blot 檢測胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達水平：將胃黏膜組織置于1~2ml 勻漿器中，經PBS 洗滌后，用剪刀將其剪碎，向其中添加總蛋白提取試劑（含蛋白酶抑制劑混合液）靜置裂解，裂解30min 后，將裂解液移至1.5ml EP 管中，然后在4℃，12000rpm 離心15min，取上清分裝于1.5ml EP 管中并置于-20℃保存。后經上樣、電泳、轉膜、染色、去離子水震蕩去除浮色，放入含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。將一抗用TBST 稀釋至適當濃度，在4℃下孵育過夜，同上方法準備二抗稀釋液并與PVDF膜接觸，室溫下孵育1h，洗滌后加入底物孵育，取出硝酸纖維素膜，蒸餾水漂洗后晾干，通過在暗盒中進行約10min 的曝光來完成顯影和定影過程。并使用Image J 軟件分析每個條帶的光密度，并重復進行3 次，靶蛋白的相對表達=［靶蛋白（光密度值）/內部參數（光密度值）］×10n，最終結果表示為均數±標準差（MeanSD）。所有陽性組患者采用相同藥物方案進行2周抗菌治療，1 個月后再次行14C-尿素呼氣試驗、胃黏膜組織病理檢測以及相關指標的測定（具體方法同上）。具體服藥方案：（泮托拉唑40mg+果膠鉍100mg）（2次/d，餐前30min 口服）+（阿莫西林1000mg+克拉霉素500mg）（2 次/d，餐后口服）。

1.3 統計學分析 采用SPSS 19.0 統計軟件。符合正態分布計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩用LSD-t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 所有Hp 感染陽性組患者密切隨訪，嚴格服用四聯藥物14d，且配合臨床醫師在療程結束1 個月后再次返院接受14C-尿素呼氣試驗及胃鏡檢查，服藥期間無明顯身體不適，且飲食生活規律。根除治療結束后1 個月，因各種原因中斷治療10 例（其中輕度5 例，中度3 例，重度2 例）。Hp 根除成功率90.67%。

2.2 RT-PCR 檢 測 胃 黏 膜 組 織miR-22，NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA 表 達 水 平 Hp 感 染 陽 性 各組胃黏膜組織中miR-22 表達水平顯著低于陰性組（P<0.05），NLRP3 炎癥小體各組成成分mRNA 表達水平均高于陰性組；隨著Hp 感染程度的加重，miR-22表達水平呈下降趨勢，NLRP3 炎癥小體各組mRNA 則呈現與miR-22 相反趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。在根除治療后，發現Hp 感染根除治療成功組miR-22 表達水平比對應各組殺菌前水平升高（P<0.05），但仍低于陰性組水平；NLRP3 炎癥小體各組分mRNA 表達水平較對應各組殺菌前水平降低。Hp 感染根除治療失敗組胃黏膜組織中的miR-22 及NLRP3 炎癥小體各組成成分mRNA 表達水平在根除治療前后差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組胃黏膜組織中miR-22，NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA表達水平比較

2.3 Western blot 檢測胃黏膜組織中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達水平 Hp 感染陽性各組胃黏膜組織中NLRP3 炎癥小體各組分蛋白表達水平均高于陰性組（P<0.05）；隨著Hp 感染程度加重，其表達水平逐漸上升，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。根除治療后，Hp 根除治療成功組胃黏膜組織中NLRP3炎癥小體各組成成分蛋白表達水平較對應各組殺菌前明顯下降，但仍高于陰性組水平，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。Hp 根除治療失敗組胃黏膜組織中的NLRP3 炎癥小體各組成成分蛋白表達水平在根除治療前后差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 各組胃黏膜組織中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達水平比較

3 討論

Hp 最早于1893 年由意大利病理學家Bizzozero 首次在動物胃內發現［4］，作為唯一可存活于胃內的細菌，具有高致病性，其借助特有的毒力因子，長期定植于宿主體內，引起一系列Hp 相關性疾?。?］。有研究表明，Hp 感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病原因，且經歷從慢性淺表性胃炎、萎縮性胃炎、不典型增生至胃癌的病理演變過程，在此過程中不同階段陽性率有所差異［6］。我國Hp 感染率約為50%~90%，高于發達國家平均水平（50%~70%），各年齡段人群Hp 感染率存差異，而男女性別差異不明顯；不同種族、信仰以及受教育程度不同，Hp 感染同樣存在差異，作者認為這可能與民族風俗、生活習慣以及易感人群等原因有關［7］。目前推薦含鉍劑四聯（PPI+鉍劑+2 種抗生素）作為主要治療根除Hp 方案［8］。近年來，隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用及經驗性治療方案的制定，致使我國Hp 對較多抗菌藥物耐藥，明顯降低臨床根除治療率［9］。因此，需尋求一種高效、且副作用小的根除Hp 的藥物。

miRNA 是近年來發現的一類長18~26 個核苷酸的高度保守的小分子RNA，其幾乎可以完全互補靶mRNA 的3'非編碼區（3'UTRs），并在轉錄水平上發揮降解作用；也可以與之不完全互補，在翻譯水平上抑制蛋白質的合成，從而在基因表達中發揮重要調節作用［10］。成熟的miRNA 形成過程通常由RNA 聚合酶II 從相應的基因組DNA 轉錄成初級miRNA，再經核酶切割形成釋放至胞質中。研究顯示miRNA 可參與細胞增殖、凋亡、炎癥、腫瘤等多種生理病理過程［11-13］。

NLRP3 炎癥小體主要表達于中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞，其異常表達可誘導一系列炎癥反應［14］，是目前研究較多的炎癥小體，其受體蛋白是NOD 樣受體蛋白3，屬于NLRs 家族，NLRs家族由N 端的Caspase 募集和活化結構域或熱蛋白結構域（PYD）、C 端富含亮氨酸的重復序列和中間的NACHT 結構域（NOD 結構域）3 部分組成。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC 和Caspase-1 所組成蛋白復合物。其在激活后可通過Caspase-1 水解前體IL-1β（pro-IL-1β）、前體IL-18（pro-IL-18）和gasdermin D，使其形成并釋放具有活性的IL-1β、IL-18 和gasdermin D 的N 端片段，被多種病原相關的分子模式或損傷相關的分子模式活化，對固有免疫系統的免疫調節過程具有重要作用［15-17］。有實驗以Hp 聯合N-甲基-N-亞硝酸脲（MNU）灌胃小鼠胃癌模型為研究對象［18］，結果顯示Hp 感染的組織中miR-22 表達抑制，而對NLRP3 的抑制減弱，誘發NLRP3 炎癥小體發生聚集及激活，導致巨噬細胞產生大量的IL-1β。大量研究表明，NLRP3 是miR-22 的直接靶點，NLRP3 炎癥小體信號通路在Hp 感染致炎過程中發揮重要作用。

本資料結果顯示，Hp 陽性組患者胃黏膜組織中miR-22 表達水平低于陰性組，而NLRP3 炎癥小體各組成成分的基因及蛋白表達水平高于陰性組；在根除后的胃黏膜組織中，miR-22 表達水平升高，同時，NLRP3 炎癥小體各組分的基因與蛋白表達水平相較于根除前各組表達水平降低。作者認為NLRP3 炎癥小體對胃黏膜具有致炎作用，而miR-22 則起到抑制炎癥的作用。在Hp 感染過程中，可能是通過抑制miR-22的表達，參與激活NLRP3 炎癥小體信號通路，致使各炎癥因子大量釋放，從而導致胃黏膜的持續性病理損傷。但其是如何導致胃黏膜炎癥改變的具體作用機制還需進一步的探索，明確此作用的關系可能為臨床中Hp 相關性疾病的防治提供理論基礎。