姜黃素通過JAK/STAT3信號通路對大鼠HSC-T6細胞凋亡的影響

武榮榮 李永祥 薛麗麗 張明洋 曹曉軒 沈婷

肝纖維化是肝臟對各種慢性刺激進行損傷修復反應時，膠原在肝內大量沉積，破壞正常肝結構的病理過程［1］。其是一種可逆性病變，逐漸加重可導致失代償性肝硬化或肝癌［2］。肝纖維化的發生發展受到多種細胞因子及其分子信號通路的調控［3］。因此，通過干預信號通路阻斷肝纖維化向肝硬化進展，對肝纖維化的研究和防治具有重要意義。姜黃素是一種從姜黃根莖中提取的多酚類化合物，主鏈為不飽和脂族及芳香族基團。目前已有多個研究發現，姜黃素通過抗氧化應激、抗炎降脂作用緩解高脂飲食、缺血再灌注等引起的肝損傷［4］。2018 年3 月至2019 年3 月作者通過實驗研究，探討姜黃素對大鼠肝星狀細胞抗纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 HSC-T6 細胞培養 大鼠肝星狀細胞HSC-T6 細胞株購自武漢普諾賽細胞生物公司。HSC-T6 細胞的培養基為含10%胎牛血清（美國Gibco 公司）、1%青鏈霉素的1640 培養液（美國Gibco 公司），培養條件為5% CO2、37℃培養箱（美國Thermo Fisher 公司）中。

1.2 姜黃素干預HSC-T6 細胞 選擇生長對數期的細胞收集制成單細胞懸液，將密度為1×104/ml 的HSC-T6 細胞接種在96 孔板。實驗分為5 組，每組6個副孔，空白組（PBS 緩沖液），對照組（TGF-β），低劑量組（姜黃素10μmol/L），中劑量組（姜黃素50μmol/L），高劑量組（姜黃素100μmol/L）。除空白組外，其余4 組先加入5μmol/L 的TGF-β（美國CST 公司）培養24h，再加入相對藥物濃度的新鮮培養液繼續培養24h。姜黃素購自美國sigma 公司。

1.3 細胞增殖實驗 HSC-T6 細胞藥物處理24h 后換無血清培養液，加入10μl/孔的CCK-8 試劑（美國Abnova 公司），繼續37℃孵育4h。處理完成后加入DMSO（150μl/孔），終止實驗，混勻后室溫靜置15min，用Multiskan GO 酶標儀（美國Thermo Scientific公司）在540nm 波長處測吸光度值。細胞存活率（%）=藥物組OD 值/空白組OD 值。

1.4 細胞凋亡檢測 將HSC-T6 細胞用胰酶消化，PBS 緩沖液洗滌后制成單細胞懸液。加入10μl AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測抗體（試劑盒購自美國BD公司），孵育15min。PBS 緩沖液洗滌后用BD Calibur 流式細胞儀（美國BD 公司）上機檢測。

1.5 熒光定量PCR 檢測 采用細胞RNA 提取試劑盒（北京天根生物公司）提取HSC-T6 細胞的總RNA，用NanoDrop 儀（美國Thermo Scientific 公司）檢測RNA 濃度和質量。用逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司）將RNA 逆轉錄為cDNA。用實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara 公司）檢測HSC-T6 細胞中JAK和Smad3 的mRNA 表達水平。PCR 儀器為美國ABI 7500 型 號，PCR 反 應 條 件 為95 ℃，10min；95 ℃，15s；60℃，1min，擴增40 個循環，60℃時收集熒光信號。PCR 引物由上海生工生物公司合成。引物序列 是：JAK2 上 游AGCCTATCGGCATGGAATATCT，下 游 TAACACTGCCATCCCAAGACA ；STAT3上 游 CTTTGAGACCGAGGTGTATCACC， 下游 'GGTCAGCATGTTGTACCACAGG ；GAPDH上 游GGATGCAGAAGGAGATCACTG， 下 游CGATCCACACGGAGTACTTG。以GAPDH 作為內參基因，采用2-△△ct計算基因的相對表達量。

1.6 蛋白免疫印跡檢測 將藥物處理后HSC-T6 細胞用緩沖液洗滌后，加入RIPA 裂解液，冰上裂解20min。離心收集上清蛋白并進行蛋白定量。用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，用PVDF 轉膜，脫脂奶粉封閉后加一抗（JAK 稀釋1 ∶1000，p-Smad3 稀釋1 ∶800，GAPDH 1 ∶1000 稀釋，），4℃搖床過夜，TBST 洗膜3 次，二抗（稀釋1 ∶1000）孵育1h，顯影，采用凝膠圖像Image J 軟件分析目標條帶的灰度值反映相關蛋白的表達水平?？贵w均購自美國CST 公司，化學發光成像儀為美國Bio-Rad 公司。以目標蛋白和GAPDH 的灰度值比作為目標蛋白的相對表達量。用Quantity One V 4.6 軟件分析結果。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17. 0 統計學軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，并進行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對活化的大鼠肝星狀細胞增殖的影響 為了解不同濃度姜黃素對大鼠HSC-T6 細胞的增殖影響，采用CCK-8 檢測細胞存活率。結果發現，經藥物處理24h 后，中、高劑量組的HSC-T6 細胞的存活率較對照組明顯降低（P<0.05），且隨著濃度的增高，存活率下降。而低劑量姜黃素組則無明顯改變（P>0.05）。見表1。

表1 不同濃度姜黃素處理組間細胞的存活率（±s）

表1 不同濃度姜黃素處理組間細胞的存活率（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05

組別 細胞存活率（%）低劑量組 78.52±4.74中劑量組 76.35±6.54*高劑量組 72.23±8.31*對照組 84.17±4.12

2.2 姜黃素對活化的大鼠肝星狀細胞凋亡的影響 通過流式檢測HSC-T6 細胞凋亡情況，PI+為死細胞，Annexin V+為活細胞。研究發現，中、高濃度的姜黃素干預HSC-T6 細胞后凋亡情況比對照組明顯（P<0.01），且呈藥物依賴性，濃度增加則凋亡更明顯。見圖1。

圖1 經姜黃素干預后HSC-T6細胞的凋亡情況

2.3 姜黃素對大鼠HSC-T6 細胞中JAK 和Stat3 mRNA 表達影響 用熒光定量PCR 檢測HSC-T6 細胞中JAK和Stat3 的mRNA 表達量，結果顯示：經姜黃素干預后，中、高劑量組均可以降低JAK 和Stat3 的 mRNA 表達下調，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。而未活化的HSC-T6 細胞中JAK 和Stat3 的mRNA 表達量低于對照組。見圖2。

圖2 經姜黃素干預后JAK和Stat3 mRNA在HSC-T6細胞中表達

2.4 姜黃素可以抑制大鼠HSC-T6 細胞中JAK 和Stat3蛋白表達 經不同濃度姜黃素干預后的HSC-T6 細胞中JAK 和Stat3 蛋白的表達明顯低于對照組（P<0.05），且隨著姜黃素濃度的增高，JAK 和Stat3 蛋白降低越明顯。未活化的HSC-T6 細胞中JAK 和Stat3 蛋白表達量較對照組低。見圖3。

圖3 經姜黃素干預HSC-T6細胞JAK和Stat3蛋白表達

3 討論

肝星狀細胞是肝臟發生纖維化的過程中的主要效應細胞?；罨母涡菭罴毎哂休^強的增殖能力，可轉化為成纖維細胞，產生大量細胞外基質，同時伴有細胞外基質降解減少［5］。而姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗感染及抗腫瘤等作用。本資料結果顯示，姜黃素可以明顯降低活化的肝星狀細胞增殖，細胞凋亡率也顯著升高，且具有濃度依賴性。肝星狀細胞增殖能力的減弱及數量減少可抑制肝纖維化的發生發展，表明姜黃素對肝纖維化大鼠的肝臟具有明顯保護作用。進一步研究發現，姜黃素可以明顯下調JAK 和STAT3 的mRNA 以及蛋白的表達。因此，推測姜黃素對肝纖維化大鼠肝臟的保護作用可能是通過降低JAK/STAT3 信號通路來抑制肝星狀細胞的增殖以及促進其凋亡，從而具有抗肝纖維化的作用。Janus 激酶/信號轉導子與轉錄激活子（JAK/STAT）通路是細胞信號轉導的重要通路之一［6］。JAK2 蛋白可通過激活下游信號STAT3的表達引起一系列的生物學作用，肝臟中存在該通路的許多成員并有表達，JAK/STAT 信號通路的異常表達可導致多種肝損傷。該通路能快速經膜至核傳導信號，廣泛參與多種細胞的各類病理、生理過程，對機體有重要影響［7-8］。有研究報道［9］，與肝纖維化有緊密聯系的炎癥因子IL-6 可激活JAK 和STAT3 蛋白，促進肝星狀細胞的分化，從而促進肝纖維化的進展。本資料結果證實，抑制JAK/STAT3 信號通路可以促進肝星狀細胞的凋亡，降低肝纖維的發生。

姜黃素存在多個作用機制靶點，具有較強的藥效學。但具有化學不穩定性、生物學活性較弱、潛在毒性等特點，導致其藥代動力學弱，臨床應用可能無效，生物利用度低。本結果雖然證實姜黃素可促進活化的肝星狀細胞凋亡，下調JAK/STAT3 信號通路，但姜黃素的作用與劑量的相關性，給藥途徑的影響等問題尚未闡明，因此需要更深入探討有關姜黃素作用及其相關機制?？傊?，姜黃素可抑制活化的肝星狀細胞增殖，促進其凋亡，其可能是機制是通過下調JAK/STAT3 信號通路，對非酒精性脂肪肝病具有潛在的治療價值。姜黃素的研究為中醫治療非酒精性脂肪肝病的研究提供新策略。