樺褐孔菌有效破壁方法及其對(duì)免疫功能的影響

雷艷敏 黃常新 王聰潔 楊麗麗

樺褐孔菌又名樺樹茸，是一種藥用價(jià)值較高的食用菌菇，因其具有抗腫瘤［1］、抗衰老［2］、降血糖［3］、抗艾滋病病毒［4］等作用，在波蘭、俄羅斯等地受到廣泛應(yīng)用［5］。日本研究者將其菌核作為艾滋病、肝癌和大腸桿菌感染的治療劑，并申請(qǐng)了相關(guān)專利［6］。另外，在毒理研究方面，束慶玉等［7］發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌無明顯生理毒性。樺褐孔菌因其細(xì)胞壁的存在，阻礙其細(xì)胞壁內(nèi)物質(zhì)的釋放。超聲粉碎儀可以通過超聲波將細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，有助于樺褐孔菌釋放細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。目前所知樺褐孔菌的主要成分有樺褐孔菌多糖、黑色素、樺褐孔菌素［8］、木質(zhì)素、樺褐孔菌醇等。已有研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤［1］、抗氧化［9-10］、護(hù)肝［11］、增強(qiáng)免疫［10］、抗疲勞［12-13］、抗病毒［4］等作用，但其具體機(jī)制尚不明確。本文探討樺褐孔菌對(duì)免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 樺褐孔菌購自大連高靜貿(mào)易有限公司；JY96-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司；LX 300 型微量離心機(jī)購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司；Balb/c 小白鼠，8 周齡，雄性，體重（26.45±0.80）g 購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；光學(xué)顯微鏡購自尼康儀器（上海）有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、PBS、Hank's 液、RPMI-1640、96 孔培養(yǎng)板、CCK-8 試劑盒購自杭州市澤衡生物科技有限公司；TNF-αElisa 試劑盒、IL-2 Elisa 試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司；IL-17 Elisa 試劑盒、TGF-βElisa 試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；CT26、K562 細(xì)胞課題組液氮凍存。

1.2 樺褐孔菌破壁提取 取樺褐孔菌120g，分為4 組，每組30g 溶于600ml 蒸餾水，分別置于不同工作條件下的超聲粉碎儀中粉碎制成溶液。見表1。

表1 各組樺褐孔菌破壁提取液超聲粉碎儀工作條件

1.3 蛋白濃度測(cè)定 （1）依據(jù)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：按50 體積BCA 試劑A 加1體積BCA 試劑B（50 ∶1），配制適量BCA 工作液，充分混勻。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10μl 稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品用PBS 液分別稀釋至0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0mg/ml 取20μl 加入到96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中。各孔加入200μl BCA 工作液，37℃放置30min。于550nm 處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）測(cè)定各組蛋白濃度：取各組樺褐孔菌水溶液離心（1000r/min，5min）取上清液，分別用PBS 液稀釋至4、8、10、16、20、32 倍濃度，各取20μl 加入到96 孔板中，各孔加入200μl BCA 工作液，37℃放置30min。于550nm 處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出各組樺褐孔菌液蛋白濃度。

1.4 體外淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn) 鼠淋巴細(xì)胞懸液制備：（1）取8 周齡、體重26.5g 的Balb/c 雄鼠1 只，頸椎脫臼法處死，在75%乙醇溶液中浸泡5min；（2）將小鼠移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌條件下，無菌取出脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去脂肪和筋膜組織，用Hank's液漂洗；（3）將脾臟放置200 目不銹鋼網(wǎng)上，用注射器針芯碾壓研碎，使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入不銹鋼篩網(wǎng)下面的RPMI-1640 培養(yǎng)液；（4）收集細(xì)胞懸液于離心管中，以1500r/min 離心機(jī)離心10min，棄上清液；加入2ml 0.83% Tris-NH4cl 溶液，靜置5min 破壞紅細(xì)胞，1500r/min 離心10min 收集細(xì)胞（見離心后所得為白色沉淀上方只有一層紅色膜為最佳狀態(tài)）；用RPMI-1640 培養(yǎng)液1000r/min 離心10min 洗滌細(xì)胞2 次以去除剩余NH4cl；（5）以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸脾細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h 以去除貼壁細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞作為脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×108/ml。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)>95%。將樺褐孔菌破壁水溶液、4 倍稀釋樺褐孔菌破壁水溶液、PBS 分別和細(xì)胞懸液按1 ∶100 的比例混合，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)對(duì)應(yīng)空白孔：樺褐孔菌破壁水溶液+培養(yǎng)液（1 ∶100 比例混合）、4 倍稀釋樺褐孔菌破壁水溶液+培養(yǎng)液（1 ∶100 比例混合）、PBS 液+培養(yǎng)液（1 ∶100 比例混合），每組3 個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)3d 后，加入CCK-8 溶液10μl 繼續(xù)培養(yǎng)4h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上450nm 處各孔吸光值OD。增殖指數(shù)PI=（實(shí)驗(yàn)孔A 值-對(duì)應(yīng)空白孔）/（對(duì)照孔A 值-對(duì)應(yīng)空白孔）×100%。

1.5 荷瘤動(dòng)物建模 取健康雄性BALB/c 小鼠16 只，體重（26.45±0.80）g，8 周齡，進(jìn)行以下造模步驟：CT26 結(jié)腸癌細(xì)胞由本課題組保存。常規(guī)復(fù)蘇和培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，1000r/min 離心5min，再用無菌生理鹽水洗滌細(xì)胞3 遍，重懸于無菌生理鹽水中，制備細(xì)胞懸液5×106個(gè)/ml。取BALB/c 小鼠左側(cè)后肢近端皮膚為注射點(diǎn)，常規(guī)75%乙醇溶液消毒局部皮膚，將5×106個(gè)/ml 細(xì)胞懸液100μl 注射至相應(yīng)部位。繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞因子測(cè)定 隨機(jī)將荷瘤鼠分為2 組：樺褐孔菌組（8 只）、生理鹽水組（8 只）；分別于接種CT-26細(xì)胞48h 后每天灌服樺褐孔菌破壁水溶液（0.015ml/g）、生理鹽水（0.015ml/g），連續(xù)喂養(yǎng)達(dá)12d 時(shí)，眼靜脈取血Elisa 法測(cè)IL-17、IL-2、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、腫瘤壞死因子α（TNF-a）濃度。

1.7 NK 細(xì)胞殺傷活性測(cè)定 將荷瘤鼠無菌取脾，計(jì)算脾臟指數(shù)，脾臟指數(shù)=（脾臟重量/小鼠體重）×100%，并獲得脾淋巴細(xì)胞懸液（步驟同1.4）作為NK 效應(yīng)細(xì)胞，以K562 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，測(cè)定NK細(xì)胞殺傷活性。具體方法：（1）脾淋巴細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液，調(diào)整密度為2×107個(gè)/ml 以備用；復(fù)蘇K562 細(xì)胞，重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）培養(yǎng)24h 后，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞>95%；（2）在96 孔板中加入NK 細(xì)胞懸液、K562 細(xì)胞懸液各100μl，每個(gè)樣品孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，另設(shè)僅含靶細(xì)胞-K562 的自然釋放孔和僅含效應(yīng)細(xì)胞-NK 細(xì)胞的自然釋放孔，以及靶細(xì)胞-K562 最大釋放孔；（3）96 孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)共4h，達(dá)3h 時(shí)在K562 最大釋放孔加入10μl LDH釋放試劑，反復(fù)吹打混勻，繼續(xù)培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h；（4）結(jié)束培養(yǎng)后，用多孔板離心機(jī)400g 離心5min，取上清液120μl 加入新的96 孔板相應(yīng)孔中，放入酶標(biāo)儀中測(cè)490nm 處吸光度；（5）計(jì)算細(xì)胞殺傷活性。細(xì)胞殺傷活性%=100×（E-ES-TS）/（TM-TS），E：殺傷檢測(cè)孔OD 值；ES：效應(yīng)細(xì)胞酶自然釋放孔OD 值；TS：靶細(xì)胞酶自然釋放孔OD 值；TM：靶細(xì)胞最大釋放孔OD 值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲粉碎儀較佳工作條件選擇 超聲粉碎儀在設(shè)置功率55W，工作時(shí)間15min 時(shí)所得樺褐孔菌破壁水溶液的蛋白濃度最高。見表2。

表2 各組樺褐孔菌破壁提取液蛋白濃度比較［mg/ml，（±s）］

表2 各組樺褐孔菌破壁提取液蛋白濃度比較［mg/ml，（±s）］

注：與組4比較，*P<0.05

組別 超聲粉碎儀工作條件 只 濃度功率（W） 時(shí)間（min）1 75 8 8 6.07±0.34 2 75 12 8 6.37±0.93 3 65 12 8 6.66±0.52 4 55 15 8 8.15±0.88

2.2 體外淋巴細(xì)胞增殖活性結(jié)果 樺褐孔菌破壁水溶液具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用（P<0.05），且樺褐孔菌破壁水溶液促淋巴細(xì)胞增殖作用較4 倍稀釋樺褐孔菌破壁水溶液促淋巴細(xì)胞增殖作用效果好（P<0.05）。見表3。

表3 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)PI（±s）%

表3 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)PI（±s）%

注：與PBS比較，*P<0.05；與4倍稀釋樺褐孔菌破壁水溶液比較，#P<0.05

組別 只 增殖指數(shù)PI樺褐孔菌破壁水溶液 8 158.82±2.77*#4倍稀釋樺褐孔菌破壁水溶液 8 146.08±6.93 PBS 8 100±0

2.3 細(xì)胞因子濃度測(cè)定結(jié)果 與生理鹽水組比較，樺褐孔菌組荷瘤鼠血清TNF-α、IL-2 濃度均偏高（P<0.05），而IL-17、TGF-β 濃度均偏低（P>0.05）。見表4。

表4 各細(xì)胞因子濃度測(cè)定［pg/ml，（±s）］

表4 各細(xì)胞因子濃度測(cè)定［pg/ml，（±s）］

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05

組別 只 TNF-α IL-2 IL-17 TGF-β樺褐孔菌組 8 168.47±11.02* 1.96±0.28* 42.52±3.18 28.44±1.01生理鹽水組 8 131.80±5.29 1.35±0.11 47.24±5.40 29.05±1.92

2.4 NK 細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與生理鹽水組比較，樺褐孔菌組NK 細(xì)胞殺傷活性較高（P<0.05），見表5。

表5 荷瘤鼠NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果（±s）%

表5 荷瘤鼠NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果（±s）%

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05

組別 只 NK細(xì)胞殺傷活性樺褐孔菌組 8 17.18±0.17*生理鹽水組 8 15.84±0.58

3 討論

樺褐孔菌，屬多孔菌科，生長環(huán)境特殊，是一種具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用的藥用真菌，而具有該藥理作用的有效成分主要存在于細(xì)胞壁內(nèi)。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)阻礙細(xì)胞內(nèi)有效成分的釋放。超聲粉碎儀利用超聲波在液體中的分散效應(yīng)，使液體產(chǎn)生空化的作用，從而使液體中的固體顆粒或細(xì)胞組織破碎。為更直觀的觀察樺褐孔菌在超聲粉碎儀作用后的有效成分釋放情況，通過比較超聲粉碎儀不同工作條件下粉碎樺褐孔菌所得水溶液的蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)在功率為55W，作用時(shí)間15min 條件下，超聲粉碎儀粉碎樺褐孔菌的效果最好。

在免疫系統(tǒng)相關(guān)方面的作用，目前已知具有增強(qiáng)免疫［14-17］、抑菌［18］、抗病毒［19-20］等，但其具體作用機(jī)制尚不明確。淋巴細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，是一類具有免疫識(shí)別功能的細(xì)胞系，在適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用，經(jīng)血液、淋巴液遍布全身，將淋巴器官和其他器官的淋巴組織連成一個(gè)功能整體，使免疫系統(tǒng)具有識(shí)別和記憶抗原能力，從而發(fā)揮識(shí)別和清除侵入機(jī)體微生物、異體細(xì)胞或大分子物質(zhì)的作用，并能監(jiān)護(hù)機(jī)體內(nèi)部穩(wěn)定性，清除表面抗原發(fā)生變化的細(xì)胞。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌破壁水溶液具有促進(jìn)鼠淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)，且該作用與樺褐孔菌水溶液濃度成一定的正相關(guān)關(guān)系。

細(xì)胞因子IL-2 又名T 細(xì)胞生長因子，是由活化的CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子。IL-2 能刺激T 細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，能增強(qiáng)T 細(xì)胞的殺傷活性，能促進(jìn)NK 細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)NK 細(xì)胞殺傷活性。（TNF-α）主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，抗感染，促進(jìn)髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，是重要的炎癥因子，并參與某些自身免疫病的病理損傷。本研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌破壁水溶液能升高荷瘤鼠體內(nèi)IL-2、TNF-α 濃度，且該作用也與淋巴細(xì)胞增值、NK 細(xì)胞殺傷活性變化相一致。

IL-17 是T 細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)啟動(dòng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)作用。同時(shí)IL-17 可以刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，并與其協(xié)同作用，提高炎癥因子表達(dá)水平，招募炎癥細(xì)胞，放大致炎效應(yīng)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。TGF-β 調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和機(jī)體免疫功能，對(duì)腫瘤既有抑制作用，也有促進(jìn)作用。在腫瘤發(fā)生早期，TGF-β 能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用；而在腫瘤發(fā)生晚期，TGF-β 能通過抑制免疫活性細(xì)胞的增殖、抑制淋巴細(xì)胞的分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞表型、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、促進(jìn)腫瘤內(nèi)血管生長對(duì)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。本資料顯示，樺褐孔菌組荷瘤鼠血清IL-17、TGF-β 濃度均低于生理鹽水組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故暫不考慮樺褐孔菌破壁水溶液通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-17、TGF-β 濃度實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。

自然殺傷細(xì)胞（NK）是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，具有抗腫瘤、抗病毒及參與免疫調(diào)節(jié)等作用。NK 細(xì)胞來源于骨髓共同淋巴前體細(xì)胞，具有部分T 細(xì)胞分化抗原。NK 細(xì)胞的活性受各種因素影響，如IL-2、IL-12、IFN-α、TNF-α 以及白細(xì)胞調(diào)節(jié)素（LR）對(duì)NK細(xì)胞的活化和分化有正調(diào)節(jié)作用，體外培養(yǎng)時(shí)加入上述細(xì)胞因子可明顯提高NK 細(xì)胞的殺傷活性，本研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌破壁水溶液能增強(qiáng)NK 細(xì)胞活性。

綜上所述，樺褐孔菌破壁水溶液通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，提高體內(nèi)細(xì)胞因子IL-2、TNF-α 濃度及增強(qiáng)NK 細(xì)胞殺傷活性實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。