膿毒血癥患者血清IncRNA H19與TNF-ɑ IL-1β及IL-6等促炎因子水平相關性分析

俞振飛 張美齊 吳微華 許志陽

膿毒血癥（Sepsis）是一種由于感染或創傷導致的微生物入侵引起全身炎癥反應的臨床急癥，其中重度膿毒血癥可導致患者全身重要組織器官損害甚至死亡［1］。當患者出現休克癥狀時死亡率達30%~70%［2］。研究表明膿毒血癥的發病機制涉及血液高凝狀態，炎癥失控，毛細血管滲漏增加心臟負荷等，其發病引發全身性炎性網絡效應，而控制患者全身炎癥反應是逆轉膿毒血癥惡性發展的關鍵［3］。近年來已發現，非編碼的微小RNA（miRNA）與膿毒血癥的發生、發展密切相關。有研究顯示16SrRNA、miRNA-21 在膿毒血癥患者的外周血中存在穩定的差異性表達，在控制炎癥方面為臨床治療膿毒血癥提供新方向［4］。而關于通常堿基序列>200b 的長鏈非編碼的RNA（IncRNA）與膿毒血癥的關系尚不清楚［5］，現研究已證明IncRNA H19 是一種較活躍的調控因子，對腫瘤細胞增殖、遷徙等均有調制作用，因此本文對IncRNA H19 在膿毒血癥患者血清中的表達進行檢測，研究其與促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 的關系，以探討血清IncRNA H19 在膿毒血癥治療中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016 年12 月至2018 年12 月本院收治的膿毒血癥患者120 例，診斷標準符合2001年美國危重病醫學會和歐洲危重病醫學會制定的關于全身性感染定義和標準，其中呼吸道感染44 例，泌尿系統感染31 例，血源性感染37 例，消化系統感染28 例，其他20 例。排除標準：放棄治療或死亡的患者，合并腫瘤或自身免疫性疾病，心源性疾病等。根據 APACHEII 評分標準將收治的病例患者分為輕度膿毒血癥組（9~14 分），重度膿毒血癥組（>15 分，包含嚴重和休克性膿毒血癥）［6］。輕度膿毒血癥組患者73 例，男33 例，女43 例；年齡23~79 歲，平均年齡（53.22±11.23）歲。重度膿毒血癥組患者47 例，其中男22 例，女25 例；年齡26~87 歲，平均年齡（51.29±9.67）歲。本研究經醫院倫理委員會批準，獲患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）樣本收集：收集所有膿毒血癥患者入院24h 及平穩恢復期血液樣本，以及健康受試者血液樣本于含肝素的抗凝管中。在1h 內1200r/min 離心5min，收集上清液置于-70℃冰箱內待檢。（2）Realtime PCR：每0.75ml Trizol 試劑混勻至0.25ml 血清樣本中，提取血清總RNA，取2μg RNA，應用德國Qiagen公司的逆 轉錄試劑盒按20μl 逆轉錄體系合成cDNA。PCR 引物應用軟件Primer5.0 設計，由上海吉瑪合成，以 GADPH 作為內參對照，引物序列：IncRNAH19 引物序列如下：上游'5-TTCAAAGCCTCCACGACTCT-3'，下 游'5-GCTCACACTCACGCACACTC-3'；GAPDH 上游5'-CG-GAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3'， 下 游5'-AGC-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。熒光定量PCR 反應體系為25μl，內含500ng cDNA 模板，終濃度為 250nmol/L 的上下游引物及SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 12.5 txl。每個樣本的表達含量以GADPH 為參照。引物序列反應條件為：95℃60s，95℃15s，退火15s，72℃45s，熒光收集，40 個循環［7］。每個樣本重復3 次。以相對CT 值（2-△△Ct）表示目的基因的相對表達量，以空白組作為對照。

1.3 觀察指標 在患者入院后第2 天早晨6 點空腹抽取靜脈血5ml，離心后取上清液，置于-20℃保存，酶鏈免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清測定促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6，試劑盒均購于上海康朗生物科技有限公司。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析。相關性分析采用雙變量Pearson 相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒血癥患者與健康者受試者血清lncRNA H19的表達情況 入院24h 急性期膿毒血癥患者中lncRNA H19 的相對表達含量高于健康組，差異有統計學意義（P<0.05）。而患者平穩期的血清lncRNA H19 表達量較急性期含量下降（P<0.05）。見圖1。2.2 輕度和重度膿毒血癥組患者血清lncRNA H19 的表達情況 入院24h 急性期重度膿毒血癥患者lncRNA H19 的相對表達含量顯著高于輕度組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖1 健康者和膿毒血癥急性期及恢復期患者的血清lncRNA H19的表達

圖2 輕度組和重度組中血清中lncRNA H19的表達。

2.3 三組患者入院24h 急性期血清各指標水平比較 與健康對照組患者比較 輕度和重度膿毒血癥組患者IL-1β，TNF-ɑ，IL-6 水平均升高（P<0.05）；與輕度膿毒血癥患者相比，重度膿毒血癥組患者IL-1β，TNF-ɑ，IL-6 水平均升高（P<0.05）。見表1。

表1 三組患者急性期血清各指標水平比較（±s）

表1 三組患者急性期血清各指標水平比較（±s）

注：與健康對照組比較，*P<0.05；與輕度膿毒血癥組比較，#P<0.05

分組 IL-1β（pg/ml） TNF-ɑ（ng/ml） IL-6（pg/ml）輕度膿毒血癥組 121.09±9.43* 82.65±5.36* 186.79±8.12*重度膿毒血癥組 146.77±16.01*# 101.36±6.59*# 246.65±18.19*#健康對照組 68.24±11.51 57.90±4.38 63.21±9.56

2.4 血清IncRNAH19 水平與膿毒血癥患者血清各指標相關性分析 入院24h 膿毒血癥患者IncRNA H19血清水平與IL-1β、TNF-ɑ，IL-6 水平呈正相關性（P<0.05）。

表2 急性期患者血清IncRNAH19水平與膿毒血癥患者血各指標相關性

3 討論

膿毒血癥是臨床常見的危急重癥，具有病情發展迅速、病死率高及預后差等特點［8］。全身炎癥反應是患者膿毒血癥進展迅猛的關鍵因素［9］。膿毒血癥在疾病發展早期就造成炎癥反應激活，產生大量炎癥因子釋放入血，反饋機體又形成更強烈的炎性反應［10］。而膿毒血癥患者在內毒素或損傷因素作用下加快促炎因子的釋放造成內皮細胞損傷及通透性的改變造成毛細血管滲漏，當毛細血管滲漏會進一步使患者全身水腫造成心臟負擔的增加［11-12］。因此膿毒血癥的發生發展與機體的炎癥反應存在密切聯系。

以往研究認為非編碼RNA 雖占據基因組的大部分而并不具備有生物學功能，視其為轉錄“噪音”，而隨著近年來對人類基因組的不斷研究，非編碼RNA的作用越發被熟知。其廣泛參與腫瘤、遺傳、炎癥等機體重要生命活動過程［13-14］。有學者發現膿毒血癥患者外周血中miR-21、miR-148a 等表達上調，而16SrRNA、miR-138 表 達 下 調［15］。提 示 非 編 碼 微小RNA 參與膿毒血癥的發生發展過程，但長鏈非編碼RNA 對于膿毒血癥的作用研究尚處于起步階段，IncRNA H19 作為長鏈非編碼RNA 被熟知，是由于其作為癌基因和抑癌基因的分子身份［16］，其在腫瘤的發生發展中起雙刃劍的作用［17］，IncRNA H19 可通過與多種微小RNA 作用調控胚胎發育、代謝過程［18］，但關于IncRNA H19 與膿毒血癥的發生、發展關系研究尚少［19］，本研究通過對120 例膿毒血癥患者的外周血清進行Real-time PCR 檢測表明，在膿毒血癥組患者的IncRNA H19 表達顯著高于健康對照組（P<0.05），且患者恢復期IncRNA H19 的表達顯著下降（P<0.05），提示IncRNA H19 與膿毒血癥的發生發展有關，有望成為治療膿毒血癥新的靶向基因。

當機體受到感染時，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 等細胞促炎因子由單核巨噬細胞和淋巴細胞誘導產生，參與機體炎癥反應，以上提及的促炎因子的血清濃度與機體炎癥反應呈正相關［20-21］；本資料結果表明，與健康對照組相比，在膿毒血癥患者住院24h 急性期時，重度膿毒血癥患者TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 明顯偏高，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 水平的總體趨勢是健康對照組<輕度膿毒血癥組<重度膿毒血癥組。通過RealtimePCR 驗證患者血清中IncRNA H19 的實際表達量，相關性研究發現促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 升高與血清IncRNA H19 水平有相關性，證實膿毒血癥患者IncRNA H19 與促炎因子形成的炎癥反應可能存在密切關系，為潛在的膿毒血癥機體炎癥反應的靶點。

膿毒血癥臨床較為常見，病情迅猛及病死率高，因此及時規范治療尤為重要。本研究通過對膿毒血癥患者血清中IncRNA H19 的監測發現，血清中IncRNA H19 與膿毒血癥患者促炎因子密切相關，其對于膿毒血癥的治療可能具有一定的臨床意義，但還需進一步揭示IncRNA H19 表達與膿毒血癥嚴重程度的相關性的具體機制，以期獲得膿毒血癥炎癥控制的新思路。