P188抑制大鼠自體脂肪移植炎癥浸潤的實驗研究

李吟秋,倪子樵,王 鑫,宋家騫,朱 飛

近年，自體脂肪移植已成為修復軟組織缺損的有效方法。移植過程中脂肪組織因遭受破壞而引發級聯反應導致的細胞凋亡是存活率低的原因之一[1]。由于創傷，機體產生應激反應，導致相關炎癥因子釋放引起炎癥反應。創傷愈合過程中多種炎癥細胞在創傷局部浸潤并引起促纖維化因子的分泌，以致成纖維細胞在創傷發生后機體愈合過程中增殖導致瘢痕[2]。當感受到炎癥刺激和危險信號的存在，巨噬細胞會發生相關變化并且釋放活性物質以及炎癥細胞因子，如白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、IL-1、IL-6，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等[3-4]。

Poloxamer 188(P188)是一種三嵌段聚合物，可以在細胞膜破損時有效恢復受損細胞膜的完整性[5]。已有文獻證明[6]，P188可以減輕興奮性腦損傷后的巨噬細胞浸潤以減輕炎癥反應，但尚無文獻針對P188對自體脂肪移植的炎癥浸潤情況進行報道。該研究將在大鼠自體游離脂肪移植模型中，觀察P188對大鼠自體脂肪移植炎癥浸潤的影響以及對移植術后存活率的影響作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料表面活性劑Kolliphor?P188(美國Sigma公司)；ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)；引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；TRIzol (美國lnvitrogen公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物與分組 隨機選取36只健康雄性SD大鼠，體質量200～300 g，均購自安徽醫科大學實驗動物中心，飼養于SPF實驗室條件下，在整個實驗過程中保持飼養環境的晝夜節律。造模前，36只大鼠常規進行分籠飼養，每籠6只，使用標準飼料，采取自由飲水，維持室溫在21～26 ℃，室內濕度控制在(50±5)%。將36只SD大鼠隨機分為2組，每組18只，分為對照組(生理鹽水組)和實驗組(P188組)。兩組大鼠于同一時間采取自體脂肪移植，于術后1、2、4周三個時間點取出標本。

1.2.2動物脂肪移植 實驗動物采用10%水合氯醛腹腔麻醉，固定，脫毛，消毒，鋪巾，于恥骨聯合上方1 cm作切口夾取皮下脂肪組織，切取脂肪組織約0.4 ml后，結扎血管，縫合傷口。將取出的脂肪組織用組織剪除去包膜與血管后，剪碎，根據實驗組和對照組需要，分別用生理鹽水與一定濃度的藥物浸潤處理30 min，留置待用。背部脫毛消毒鋪巾，在脊柱兩側分別作約1.5 cm圓形標記區域，分別作一小切口，止血鉗皮下鈍性分離，將剪碎的脂肪組織分別用生理鹽水和相應濃度的藥物處理后，用1 ml注射器分別將處理好的脂肪組織對應注射進分離好的間隙，每只大鼠背部兩側各注入脂肪組織(0.2±0.02)ml，體質量約為(0.25±0.05)g，最后縫合傷口。分別在術后1、2、4周取出移植脂肪組織。同時腹主動脈取血，置于離心機以6 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃凍存,用于ELISA實驗測定。

1.2.3脂肪組織稱重及體積測量 將取出組織置于無菌操作臺上，去除其表面覆蓋的筋膜。用超精密電子秤稱重。取1 ml醫用注射器，用蠟塊封死注射器的針尖端，在自制注射器中加入0.4 ml蒸餾水，依次將取出的脂肪組織放置入內，記錄量筒內液面上升的高度，高度差即是取出的脂肪組織體積。

1.2.4組織學觀察 將取出的脂肪組織用10%福爾馬林固定24 h，經過4%多聚甲醛固定，津蠟，包埋，2 μm厚度連續切片，HE染色，光鏡下觀察脂肪組織形態結構。

1.2.5實時定量熒光PCR檢測炎癥因子的mRNA表達 將各組脂肪組織用Trizol裂解后，勻漿，按照試劑盒說明書，抽提總RNA樣品，逆轉錄獲得cDNA，設計引物，然后使用SYBR Green PCR mix 試劑盒分別檢測IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平，后用Real-time PCR檢測炎癥因子的mRNA表達。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6ELISA試劑盒檢測炎癥因子的蛋白表達 檢測IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達情況。將血清樣品從冰箱取出，用恒溫水浴箱解凍，按照ELISA試劑盒說明書，經過包被抗體洗滌，加入血清樣品孵育洗滌，加入酶標再孵育洗滌和加底物顯色等步驟，最后用酶標儀在450 nm波長下讀取OD值。

2 結果

2.1 脂肪組織稱重及體積測量結果顯示，脂肪移植1、2周時，實驗組與對照組之間體質量和體積比較差異無統計學意義；4周時對照組體質量為(0.13±0.02)g，實驗組體質量為(0.19±0.02)g，兩組比較差異有統計學意義(F=113.781,P<0.01)；4周時對照組體積(0.15±0.03)ml，實驗組體積為(0.19±0.01)ml，兩組比較差異有統計學意義(F=75.347,P<0.05)。見圖1。

圖1 P188對移植后脂肪組織的體積和體質量的影響

A：體積；B：體質量；與生理鹽水組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.2 組織學觀察HE染色顯示，對照組炎癥反應較強，炎性細胞占據大部分視野，結構紊亂，脂肪細胞松散無規律，可見脂肪液化以及壞死。至4周時可見纖維結締組織較多。而添加了P188的實驗組在2周時可見到較多脂肪細胞產生，至4周時可見組織間隔不多，新生脂肪細胞排列相對整齊，形態規則。見圖2。

2.3 實時定量熒光PCR檢測炎癥因子的mRNA表達4周時，實驗組移植脂肪組織中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達水平低于對照組，差異有統計學意義，其中IL-1α、IL-1β、IL-6(FIL-1α=45.158， FIL-1β=137.533，FIL-6=65.187，P<0.05)，TNF-α(FTNF-α=365.781，P<0.01)。見圖3。

2.4 ELISA試劑盒檢測炎癥因子的蛋白表達圖4結果顯示在自體脂肪移植4周時，P188作用實驗組可以降低炎癥因子1L-1β、IL-6、以及TNF-α的表達，且差異有統計學意義，其中IL-1β、IL-6(FIL-1β=34.607，FIL-6=16.224，P<0.05)，TNF-α(FTNF-α=198.633，P<0.01)。而IL-1α的蛋白表達水平雖然有下降趨勢，但差異無統計學意義(FIL-1α=54.657，P>0.05)。

圖2 HE染色觀察移植后脂肪組織炎癥浸潤 ×200

圖3 兩組炎癥因子mRNA的表達情況

圖4 兩組炎癥因子蛋白表達情況

3 討論

自Neuber于1893年完成第一例脂肪移植術至今，自體脂肪移植已經成為當下整形手術以及組織修復重建手術的熱點。由于脂肪移植存在多個步驟，且會對局部組織造成一定程度的損傷，伴隨的炎癥反應不可避免的會對移植存活率造成影響。炎癥反應存在于多種病理過程中，炎癥反應的激活、炎癥細胞因子的分泌對創傷發生后機體愈合過程中局部組織的修復和功能的重建有著重要影響作用。除巨噬細胞之外，局部炎癥反應對成纖維細胞的增殖也有促進作用[7]，在局部創面愈合過程中，促炎性因子的分泌，炎性細胞因子的釋放導致炎癥反應的激活，從而引起成纖維細胞的增殖。研究表明[8]，促炎因子的高表達，抑炎因子的低表達，促進形成瘢痕組織及瘢痕疙瘩。

脂肪組織中除脂肪細胞外，還有成纖維細胞、前脂肪細胞、巨噬細胞等。巨噬細胞是與炎癥相關的至關重要的細胞之一。由于炎癥反應集中在脂肪移植術后早期階段，故為驗證P188對脂肪移植的影響作用，取出脂肪組織的時間點設置在移植后早期，通過評估P188對脂肪移植的早期影響作用，可以有效評估其遠期效果[9]。有文獻[10]報道，在脂肪移植過程中，移植的成熟脂肪細胞會因缺氧缺血而凋亡，而前體脂肪細胞分化為脂肪細胞來替代壞死細胞，從而重新構建移植脂肪的結構。高水平的巨噬細胞浸潤會抑制前體脂肪細胞的成脂傾向，因此可以推斷，抑制脂肪移植炎癥反應，會對脂肪移植存活率產生影響。正常生理環境下，脂肪細胞分泌的多種細胞因子處于動態平衡狀態，當受到環境威脅時，穩定狀態失衡，促進IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增加從而使巨噬細胞活化。與巨噬細胞一樣，脂肪細胞表達了大量受體，對炎癥因子介導的炎癥反應非常敏感，多個炎癥信號轉導級聯反應被激活，分泌相關炎癥因子[11]。脂肪細胞對TNF-α十分敏感，TNF-α對脂肪細胞的生理功能產生多種影響, 包括活化細胞因子的基因表達[12]。

Poloxamer188是一種合成表面活性劑，是一種非離子三嵌段共聚物，可插入人工脂質單層膜中，修復受損的生物膜。已有文獻[13]研究證明，P188可以減輕興奮性腦損傷后的巨噬細胞浸潤，以減輕炎癥反應。Ruhl et al[14]通過體外細胞實驗證實P188對脂肪細胞的增殖及分化有促進作用，對相關因子的釋放如IGF-1 ，VEGF等雖有影響，但作用甚微，不具備統計學意義。

本實驗通過對移植后1、2、4周的脂肪炎癥因子進行檢測發現表面活性劑P188對移植前兩周的脂肪細胞保護和抑制炎癥浸潤的作用并不明顯，與生理鹽水組差異無統計學意義；而4周組的結果表明，P188組不僅能抑制炎癥的浸潤并且可以抑制炎癥因子1L-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA和蛋白水平的表達(與對照組比較，差異有統計學意義，1L-1β、IL-6,P<0.05; TNF-α,P<0.01)。

綜上所述， 通過對實驗結果的觀察和數據的比較，P188可以減輕自體脂肪移植術過程中產生的炎癥反應。因此也可以推斷，在創傷愈合領域，因P188對炎癥反應具有抑制效應，而對瘢痕以及瘢痕疙瘩的形成具有抑制作用，在整形外科修復創面方面的應用有待發掘。