芍藥苷-6-O′-苯磺酸酯對Caco-2細胞中P-gp表達和功能的調控

王 斌，王 劍，湯 浩，孫 偉，王 勇，肖 峰，王 春，姜 玲,2，魏 偉

芍藥苷-6-O′-苯磺酸酯(benzene sulfonyl paeoniflorin，CP-25)是芍藥苷(paeoniflorin，Pae)的結構修飾產物，具有較強的抗炎免疫調節活性。研究[1]顯示CP-25的生物利用度和吸收能力優于Pae。單次腸灌流大鼠模型的研究表明CP-25的腸吸收優于Pae。結果表明，Pae的吸收弱是由于滲透性差，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)外流和腸道降解[2]引起的。P-gp是 ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉運體家族中重要的外排轉運蛋白[3]。P-gp在人和其他哺乳動物的腸上皮細胞的基頂側表面、膽小管和腎近端小管表達量很高，其生理功能是轉運內源性代謝產物或外源性異物。很多臨床上常用的免疫抑制藥物都是P-gp的底物包括甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、糖皮質激素等，患者長期使用而引起P-gp的表達增加，因此降低藥物療效，產生耐藥性。CP-25是抗炎免疫調節藥物，能夠降低關節炎大鼠滑膜組織中P-gp的表達，對Caco-2細胞是否具有調控作用尚不清楚。因此，該研究旨在探討CP-25對Caco-2細胞中P-gp的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 CP-25(白色粉末、純度>98%)購自安徽醫科大學臨床藥理研究所；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM培養基購自美國Hyclone公司；青霉素和鏈霉素溶液以及Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)購自北京Solarbio公司；十二孔細胞培養板購自美國Costar公司；羅丹明123(RHO 123)購自美國Sigma公司；P-gp單克隆抗體(克隆UIC2)購自英國Abcam公司；流式細胞術試劑購自美國Becton Dickinson公司；P-gp抗體購自美國Santa公司；Phospho-NF-kB p65抗體購自美國CST公司。CoraLite594-綴合的山羊抗兔IgG(H+L)購自武漢ptgcn公司。牛血清白蛋白(BSA)和Triton X-100購自上海Beyotime公司。

1.1.2實驗細胞株 Caco-2細胞購自American Type Cell Culture儲存庫(Manassas，VA)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞極性研究 將細胞接種在75 cm2的培養瓶中并在DMEM培養基中培養。 15 d后，在光學顯微鏡下觀察細胞并拍照。將Caco-2細胞在12孔Transwell室中培養9、15、21 d，并用平衡的鹽溶性HBSS溶液(pH=7.4)在37 ℃條件下洗滌單層細胞2～3次。孵育20 min后，將孔中的溶液吸干，并根據試劑盒的方法測定單層細胞腸腔(AP)和基底側(BL)的堿性層磷酸酶的活性。

1.2.2轉運實驗 為了檢測pH對CP-25和Pae轉運的影響，用HBSS培養基稀釋CP-25和Pae并用HCl調節以得到一系列pH值(pH 5.0、pH 6.0和pH 7.4)。處理所有樣品并計算CP-25和Pae的Papp。

1.2.3P-gp表達和活性分析 將細胞以6.0×104個細胞/cm2的密度接種到24孔板上。在實驗當天，用PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌細胞2次，并用不同濃度CP-25和Pae(0、5.0、10.0、20.0 μg/ml)及空白對照組、維拉帕米陰性對照組處理48 h后，用PBS洗滌細胞兩次，用胰酶消化，得到細胞懸浮液。然后將細胞分成2個約2.5×105個細胞的等分試樣，分別用于檢測P-gp活性和表達。

研究CP-25對P-gp表達的影響：將細胞離心并懸浮在含有10% FBS與FITC綴合的P-gp抗體(UIC2)的PBS緩沖液(pH 7.4)中，通過與對照組比較，考察CP-25對Caco-2細胞中P-gp表達的影響。

研究CP-25對P-gp活性的影響：胰蛋白酶消化后，使用含有FBS的DMEM將處于對數生長期的Caco-2細胞分散為單細胞懸浮液，將細胞分別以1.0×106個細胞/cm2的密度接種到磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的2.0 ml EP管(300 μl/管)中，后將細胞在37 ℃下與不含或含有各種濃度的藥物(維拉帕米、CP-25和Pae)的1.0×10-3mol/L RHO 123一起孵育40 min。孵育后用PBS洗滌細胞3次，然后離心5 min。之后，將細胞用含有10% FBS的PBS洗滌2次，懸浮于冰冷的PBS中，立即檢測P-gp的表達。通過(530±15)nm帶通濾波器(FL1)檢測RHO 123的綠色細胞內熒光。通過與空白對照比較，考察CP-25對Caco-2細胞中RHO 123積累的影響。

1.2.4Phospho-NF-кBp65和P-gp表達分析 將Caco-2細胞以6.0×104個細胞/cm2的密度接種到六孔板上。然后加入不同濃度的CP-25和Pae(0、5.0、10.0、20.0 μg/ ml)及空白對照組處理48 h后，用PBS洗滌細胞2次，加入含有磷酸酶抑制劑和PMSF的裂解緩沖液，冰上裂解30 min。將細胞刮下，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法對蛋白進行定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法將蛋白轉移至PVDF上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜，與二抗結合2 h后，顯影。

1.2.5Phospho-NF-кBp65的表達 將圓形蓋玻片用75%乙醇浸泡過夜，夾入24孔板，加入無菌PBS沖洗2次。待細胞貼壁后，更換成不含血清的培養基，并用不同濃度CP-25(0、5.0、10.0、20.0 μg/ml)及空白對照組處理48 h后，吸棄培養基，加入4%固定液(用PBS制備4%多聚甲醛和4%蔗糖)，室溫固定15 min后，用PBS洗滌3次。加入0.2% Triton-X 100，室溫放置10 min。再加入5%的BSA封閉30 min后加入PBS洗滌3次。孵一抗并4 ℃過夜后，加入PBS洗滌3次。然后加入熒光標記二抗避光孵育1.5 h，PBS洗滌玻片3次。最后加入DAPI工作液染色，避光孵育5 min，PBS洗滌玻片3次。滴上1小滴防淬滅封片劑于載玻片上，取出蓋玻片，用吸水紙吸干蓋玻片上殘余的液體，細胞朝下，輕輕叩于封片劑上，4 ℃避光保存。

1.2.6數據分析 表觀滲透系數Papp按以下方程進行計算：Papp=(ΔQ/Δt)*[1/(A*C0)][4]，其中ΔQ/Δt是接收側化合物的累積傳輸速率，A是細胞單層的表面積(cm2)，C0是供體室中的初始濃度。

2 結果

2.1 細胞形態學檢查和極性研究在光學倒置顯微鏡下，Caco-2細胞在第6 天和第7天緩慢融合生長，第15天逐漸變得均勻，致密和透明，如圖1所示。

圖1 Caco-2細胞顯微鏡照片(第15 天) ×200

不同生長階段的細胞單層堿性磷酸酶活性的結果如圖2所示。從圖中可以看出，堿性磷酸酶活性比(AP / BL)隨時間迅速增加(0.2±0.1、0.7±0.1、1.1±0.2)(F=6.283、14.93、38.77；P<0.05，P<0.01)，第21天的活性比第9天高約5倍，表明堿性磷酸酶的分布非常不對稱。其中大部分都局限于刷狀緣一側，細胞生長是具有極性的。

圖2 Caco-2細胞的堿性磷酸酶活性

2.2 pH對CP-25和Pae轉運的影響pH對CP-25和Pae轉運的影響如圖3A和圖3B所示。與pH 7.4相比，CP-25和Pae的膜滲透在pH 4.0和pH 6.0下升高(FA=26.88、FB=33.43，P<0.01)。 這些數據表明CP-25和Pae在pH 4.0和pH 6.0環境中具有很強的滲透性。當 Papp<1×10-6cm/s時，藥物的吸收率較低。因此CP-25吸收高于pH 7.4時的Pae。

2.3 CP-25對Caco-2細胞中P-gp表達的影響結果如圖4所示，與空白對照組相比較，CP-25組和維拉帕米組的P-gp表達較低，差異具有統計學意義(F=47.54、15.14；P<0.05)。結果提示CP-25對P-gp表達有下調作用。

2.4 CP-25對Caco-2細胞中P-gp轉運活性的影響如圖5中所示，CP-25和維拉帕米在濃度為10.0 μg/ ml和20.0 μg/ ml時可以增加Caco-2細胞對RHO123的攝取，提高細胞內熒光強度，差異具有統計學意義(F=29.65、14.11P<0.05)。此外，Pae在濃度為10.0 μg/ ml和20.0 μg/ ml時也能夠增加Caco-2細胞對RHO123的攝取。結果提示，Pae的RHO123的細胞內積累低于CP-25，說明CP-25對P-gp的抑制作用強于Pae。

圖3 pH對Caco-2細胞單層CP-25和Pae轉運的影響

圖4 Caco-2細胞中P-gp表達水平的流式細胞術分析

圖5 CP-25對Caco-2細胞中P-gp轉運活性的影響

圖6 CP-25對Caco-2細胞中Phospho-NF-κBp65和P-gp表達的影響

2.5 CP-25對Caco-2細胞中Phospho-NF-κBp65和P-gp表達的影響如圖6所示，不同濃度的CP-25(5、10、20 μg/ ml)處理48 h后，Caco-2細胞中Phospho-NF-κBp65和P-gp表達水平隨著藥物濃度的增加而減少(FA=5.041、FB=152.6；P<0.05、P<0.01、P<0.001)。提示CP-25可以降低Phospho-NF-κBp65和P-gp的表達。

2.6 CP-25對Caco-2細胞中Phospho-NF-кBp65表達的影響如圖7所示，不同濃度的CP-25(5、10、20 μg/ml)處理Caco-2細胞48 h后，通過共聚焦顯微鏡觀察CP-25對Caco-2細胞中Phospho-NF-кBp65表達的影響。與Control組比較，5、10、20 μg/ml組熒光表達降低(0.6±0.1，0.6±0.1，0.5±0.1)(F=9.573，P<0.01)，提示CP-25可降低Caco-2細胞中Phospho-NF-κBp65表達。

3 討論

Caco-2細胞來源于人類結腸直腸癌并且與小腸的腸細胞非常相似[5]，在培養的過程中融合，之后表現出自發的形態和生化的腸細胞分化[6]。在Caco-2細胞中所表達的P-gp[7-9]水平與正常人空腸[10]相同。此外，P-gp存在于Caco-2細胞的頂膜中也證實了其在該腸細胞系中的極化表達[11]。在實驗性Caco-2細胞模型中，隨著時間的延長，堿性磷酸酶活性比(AP / BL)迅速增加。堿性磷酸酶活性高于培養后第9～21天，增加約5倍，表明此時堿性磷酸酶的分布非常不對稱，其中大部分集中在刷狀緣一側，細胞生長極性且完全分化，符合轉運實驗要求。

圖7 CP-25對Caco-2細胞中Phospho-NF-кBp65表達的影響

在Caco-2細胞模型中，通常表觀滲透系數Papp被用來評估藥物攝取的生物利用度。通過研究各種化合物的轉運機制，Artursson et al[12]發現Papp大于1.0×10-6cm/s時，認為該化合物能夠被很好地吸收，而Papp小于1.0×10-6cm/s時，該化合物被認為吸收一般。據報道，在pH為7.4[13]的環境中，Pae在結腸中被吸收較低。實際上，本研究證實在pH為7.4的環境中，Pae轉運滲透率最低，原因可能是Pae中的單酯基團會水解，從而降低其吸收率。另外，在pH值為7.4時，CP-25的轉運滲透率低于4.0的pH值和6.0的pH值。但根據Papp值，當Papp小于1×10-6cm/s時，藥物吸收性差。因此CP-25吸收大于pH為7.4時的Pae。

在該實驗中，選擇RHO123作為P-gp底物。RHO123是P-gp的經典底物，其經常作為工具藥物用于研究P-gp在腸細胞膜中的功能。細胞中RHO123累積量的變化可以準確地代表P-gp[14]的功能。維拉帕米是P-gp的抑制劑，可以增加Caco-2細胞中RHO123的積累[15]，用作陽性對照藥。與對照組相比，維拉帕米可顯著增加RHO123細胞內積累量。這一結果證明，通過測定RHO123積累量的變化來研究被測藥物對P-gp活性的影響，實驗方法是可行的，其結果表明CP-25可顯著增加RHO123的細胞積累。Western blot和共聚焦顯微鏡觀察結果顯示，CP-25可顯著下調P-gp和Phospho-NF-кBp65的表達。核轉錄因子-кB( nuclear factor κB，NF-кB)是由p65和p50組成的二聚體轉錄因子。當受到外界刺激時，IkB蛋白被磷酸化，釋放出的NF-кB轉移至細胞核并激活下游目的基因。以上說明CP-25是影響P-gp活性和表達的有效成分，可能是P-gp的抑制劑。

綜上所述，CP-25能夠下調Caco-2細胞中P-gp的表達，其分子機制可能與阻斷NF-кB 信號通路激活有關。