胃癌患者唾液中篩選嘌呤代謝相關的診斷標志物

包楚陽，向麗娟，劉 虎，汪圣毅，王亞雷

癌細胞的增殖不僅需要大量能量，對增殖合成的底物也有大量需求。而嘌呤是所有生物體最豐富的代謝底物，它不僅是RNA和DNA的核心構建模塊之一，嘌呤代謝還提供了大量重要生物合成所需的能量和輔助因子[1-2]。現通過收集178例胃癌和良性胃病患者的唾液樣本，針對胃癌的嘌呤代謝進行分析，試圖尋找有價值的診斷標志物。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院2017年3月～2018年1月外科術后148例胃癌患者和消化內科胃鏡室30例胃炎患者。所有入組患者均有明確組織病理學診斷。本研究經安徽醫科大學倫理委員會批準(批準號：20140141)。已獲得所有患者和唾液供體志愿者的書面知情同意書，該研究嚴格遵守赫爾辛基宣言。

納入標準：① 所有胃癌和良性疾病組患者均有明確的病理診斷；② 所有入組患者均可以收集到完整的病案資料和輔助檢查資料；③ 年齡≤80歲。排除標準：① 存在其他嚴重的心、肺、肝、腎功能異常病史及糖尿病等異常代謝疾病；② 近期有過上呼吸道感染；③ 存在其他的口腔疾病。

1.2 標本收集所有唾液標本提供者在收集前1 d晚上10：00之后不允許進食任何食物。所有標本在收集當天清晨使用2 ml凍存管收集，并且收集前1 h不得進行飲水、吸煙、刷牙和劇烈運動。所有的唾液樣本在收集后封存于-80 ℃冰箱中，使用裝有干冰的泡沫箱封裝運輸。

1.3 儀器與試劑Agilent 1290 UHPLC超高效液相色譜儀；AB Sciex& Agilent Triple TOF 6600/6550高分辨質譜儀(美國Agilent)；Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17離心機(日本Thermo)；深圳市雷德邦電子有限公司PS-60AL超聲儀；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm; 2.1×100 mm)(美國Waters)；CNW Technologies公司純度LC-MS級的甲醇、乙腈醋酸銨、氨水(德國杜塞爾多夫)；上海恒柏生物科技有限公司純度≥98% 的L-2-氯苯丙氨酸。

1.4 唾液樣本的處理將唾液樣本在4 ℃下冰上解凍，于EP管中以100/400 μl(樣本/提取液)渦旋混勻；在-20 ℃孵育以沉淀蛋白質，離心；取新鮮上清液，在不加熱的真空濃縮器中干燥提取物，加入提取液重構；再次渦旋超聲水浴并離心后，將上清液轉移到新鮮的LC/MS采樣瓶中，每個樣品取10 μl，合并為質控 (quality control，QC) 樣品。之后對樣品進行UHPLC-QTOF-MS 分析。

1.5 LC-MS參數和數據預處理LC-MS所用色譜柱為UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm; 2.1×100 mm)。進樣體積為pos: 2 μl，neg:3 μl。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子譜峰進行采集對應的二級質譜數據。轟擊能量：30 eV，每50 ms產生15張二級譜圖。ESI離子源參數設置如下：霧化氣壓：60 Psi，輔助氣壓：60 Psi，氣簾氣壓：35 Psi，溫度：650 ℃，噴霧電壓：5 000 V(正離子模式)。再使用XCMS軟件做保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊。使用自撰寫R程序包和自建二級質譜數據庫對峰進行物質鑒定。(唾液樣本液相色譜-質譜分析由Shanghai Biotree Biotechnology公司完成)

1.6 數據處理與統計分析使用多元統計分析中的正交偏最小二乘法分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis, OPLS-DA)第一變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP )以及單變量統計分析的學生t檢驗來篩選差異代謝物，差異代謝物的篩選標準以VIP值大于1，t檢驗以及秩和檢驗的P<0.1為有統計學意義。將差異代謝物與嘌呤代謝通路映射匹配分析進行代謝通路分析(差異代謝通路分析和差異代謝物分析由Shanghai Biotree Biotechnology公司定制R Package分析完成)。使用SPSS16.0來進行差異受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC curve)分析，評估差異代謝物以及差異代謝物的組合對樣本進行區分的效果，使用Fisher判別分析計算差異代謝物的診斷函數。

2 結果

2.1 患者的流行病學資料本次研究征募唾液樣本志愿者共178例，年齡為25～78(59.84±11.57,P<0.001)歲，在148例胃癌患者中男性119例，女性29例；30例良性胃病患者中，男性21例，女性9例。按TNM分期來觀察，胃癌組患者中，T1患者18例；T2患者42例；T3患者76例；T4患者8例，分期不明的患者4例。

2.2 LC-MS數據處理和差異代謝物的篩選在178例受試者的唾液中共鑒定出3 638個峰，經過對原始數據進行數值標準化處理后3 637個峰被保留，通過二級質譜匹配分析得到374個常規代謝物或二級碎片，根據峰面積的強度值來評估代謝物的水平，經過經過兩組間的信號強度比值和OPLS-DA分析的VIP值以及組間單變量學生t檢驗分析后得出164個代謝物用于后續分析。見表1。

2.3 嘌呤代謝物分析對嘌呤代謝通路內92個代謝物或二級碎片，在經過兩組間的定量比值和OPLS-DA分析的VIP值以及組間單變量學生t檢驗分析后得出4個符合篩選卡值標準的代謝物。在代謝組學數據分析中，通常使用ROC曲線來評估差異代謝物或其組合對組間樣本的區分的效果，即通過ROC曲線評估差異代謝物的組間判別能力。在對以上4種差異代謝物進行ROC曲線分析，結果顯示在胃癌患者中唾液樣本中嘌呤代謝通路內的黃嘌呤核苷、環鳥苷酸和脫氧核苷一磷酸相較于胃良性病患者出現了下調，而尿酸則呈現上調。見圖1。

表1 差異代謝物和差異代謝通路的篩選

RT：該物質的色譜中的保留時間；MC：該物質在該組對比內的癌癥組的相對定量值均值；MB：該物質在該組對比內的良性組的相對定量值均值；FC：Fold_Change特定代謝物在胃癌組與胃良性病組定量的比值。該表列舉幾個嘌呤代謝的中間產物作為示例，部分產物因其統計分析的差異值不明顯且判別分析貢獻值較小沒有納入下述的診斷模型；篩選卡值標準：VIP值>1，P<0.1

圖1 嘌呤代謝通路中4個差異代謝物的ROC曲線

脫氧核苷一磷酸曲線下面積(area under curve, AUC)=0.38(95%CI=0.27～0.49)；黃嘌呤核苷AUC=0.294(95%CI=0.20～0.39)；環鳥苷酸AUC=0.13(95%CI=0.06～0.19)；尿酸AUC=0.711(95%CI=0.61～0.81)

2.4 嘌呤代謝物的診斷函數模型針對上述分析結果中的4種差異代謝物使用Fisher判別分析建立差異代謝物的診斷函數模型。

診斷函數：y1=65.973x1+24.766x2-22.641x3-0.2x4-1.489

y2=32.690x1-22.685x2+29.897x3+13242x4-1.137

上述函數中x1為唾液中的黃嘌呤核苷，x2為環鳥苷酸，x3為脫氧核苷一磷酸，x4為尿酸。若單個樣本的y1值大于y2，則視為良性胃病，若y1小于y2則將其視為胃癌，P=0.013。使用留一法交叉驗證分析得出該模型的靈敏度為83.1%，特異度為63.3%。

3 討論

目前已有多項針對膀胱癌、乳腺癌等多個癌種進行了代謝組學相關研究，發現癌癥患者的血液、尿液以及呼氣中有多種明顯差異的代謝物，在經轉錄組學整合分析后發現大多數差異代謝物與嘌呤代謝密切相關[3-4]。本次研究收集了148例胃癌患者和30例胃良性病患者的唾液進行UHPLC-QTOF-MS分析，篩選出4個較明顯的差異代謝物，分別為環鳥苷酸、黃嘌呤核苷、腺嘌呤脫氧核苷以及尿酸。相較于良性胃病的患者，在胃癌患者的唾液中環鳥苷酸、黃嘌呤核苷和腺嘌呤脫氧核苷出現下調，而尿酸呈上調。

在人體內，嘌呤核苷酸的合成方式有2種，一種是從頭生物合成(de novo synthesis)途徑，另一種是互補的補救合成途徑。從頭合成主要中間產物為肌苷一磷酸(inosine monophosphate, IMP)，IMP可以繼續通過中間產物黃嘌呤一磷酸(xanthine monophosphate, XMP)合成為鳥嘌呤一磷酸(guanosine monophosphate, GMP)或者直接合成腺嘌呤一磷酸(adenosine monophosphate, AMP)、GMP和AMP 繼續進入各自的循環并最終合成DNA或RNA，由于腫瘤細胞不受限制增殖產生了其對RNA、DNA大量需求，這可能導致鳥嘌呤、腺嘌呤代謝循環的改變以及環鳥苷酸和脫氧核苷一磷酸相應的下調。另外的補救合成途徑主要存在于缺乏從頭合成的細胞或組織中，通過循環回收堿基來合成嘌呤核苷酸以滿足機體平時的代謝需求。在本次研究中幾種嘌呤核苷酸的相應衍生物如鳥苷、腺苷、肌苷均出現了不同程度的下調，其中黃嘌呤核苷最為明顯。大致代謝過程見圖2。

對于腫瘤細胞，由于從頭生物合成能夠產生巨大能量和各種細胞原材料，可以滿足癌細胞的各種增殖需求。在腫瘤組織中，由于補救合成途徑的中間代謝物被用于細胞增殖而次黃嘌呤的回收途徑利用率下降，導致了嘌呤降解增加從而產生了尿酸的上調，最近也有研究[5-6]顯示血清中的尿酸濃度可以作為評估乳腺癌的預后因素。而鳥苷一磷酸、脫氧腺苷一磷酸以及黃嘌呤核苷這3種代謝物目前在

圖2 嘌呤的補救合成途徑

橙色箭頭：從頭合成方式(de novo synthesis)；綠色箭頭：嘌呤補救合成途徑；紅色箭頭：嘌呤降解，最終產物為尿酸；深色標記的4個代謝物為本次研究的診斷標記物；綠色：下調，紅色：上調

嘌呤代謝通路內的作用未發現有研究揭示說明。對于本次研究所發現的在胃癌患者唾液樣本中這3種代謝物出現的不同程度下調的原因，推測可能與腫瘤組織不受限制的增殖需求以及腫瘤環境中嘌呤代謝途徑改變有關，但其具體的分子水平代謝機制仍不清楚，有待進一步的體外細胞試驗來探索和證實[7-8]。