低劑量伽瑪刀照射對癲癇大鼠皮層及海馬神經細胞內游離Ca2+水平的影響

尹 昱，王曉晗，王賀波，孫增鑫，董長征，李文玲，趙文清，趙振彪

目前關于伽瑪刀照射作為開顱手術治療癲癇的替代方案的研究日益增多[1-2]。臨床研究[3-4]顯示低劑量伽瑪刀可控制難治性癲癇患者的癇性發作，并可保護該類患者的認知功能，但作用機制仍不十分明確。目前認為鈣離子與學習、記憶等認知功能密切相關，而研究[5]顯示鈣穩態失調還可誘發癇性發作，當細胞內的鈣濃度超過正常水平，但劑量未達到產生興奮毒性的程度時，鈣濃度異常升高可能引起神經細胞異常放電進而導致癲癇。低劑量伽瑪刀是否通過影響神經細胞內Ca2+濃度水平而發揮抗癲癇和保護認知的作用，有待進一步深入探討。現利用激光共聚焦顯微鏡檢測戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠額葉及海馬神經細胞內游離Ca2+水平，并觀察低劑量伽瑪刀對其的影響，以期為伽瑪刀治療癲癇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與癲癇模型制備選取清潔級健康雄性Wistar大鼠32只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，起始體質量180～220 g，均在同一實驗室按清潔級大鼠要求飼養，22～25℃環境溫度，12 h光亮/黑暗條件，自由進食水。根據大鼠是否應用PTZ致癇及接受低劑量伽瑪刀照射，隨機均分為4組：正常對照組、伽瑪刀對照組、PTZ致癇組、PTZ致癇+伽瑪刀組。采用腹腔連續注射PTZ溶液(Sigma 公司，美國)(35 mg/kg)制備癲癇大鼠模型，每24 h注射1次，連續注射4周，每次注射后觀察大鼠出現癇性發作的表現。采用修正RacineⅥ級評價標準對大鼠癲癇發作情況進行評定[6]。在大鼠4周連續應用PTZ期間內，如Ⅳ級以上的癲癇發作連續出現3次，即被視為癲癇模型制備成功，并用于后續的實驗，此后仍每周腹腔注射1次相同劑量的PTZ以維持發作。正常對照組大鼠腹腔注射同等容量的生理鹽水；伽瑪刀對照組僅給予伽瑪刀照射；PTZ致癇組大鼠由PTZ制備癲癇模型；PTZ致癇+伽瑪刀組大鼠經PTZ制備癲癇模型后再接受低劑量伽瑪刀照射。

1.2 低劑量伽瑪刀照射PTZ連續注射4周，癲癇模型制備成功后，應用Leksell伽瑪刀系統(ELEKTA，瑞典)對實驗大鼠進行單次低劑量伽瑪刀照射，實驗大鼠麻醉后(腹腔注射水合氯醛，35 mg/kg)固定在動物架上，再將其置于伽瑪刀的Leksell框架上，應用核磁共振儀(Signa 1.5T)對大鼠進行定位掃描，以大鼠雙側額葉為照射靶區，并根據核磁圖像在Gamma Plan系統上確定雙側額葉的坐標軸，以50%等劑量線包圍靶區，邊緣劑量為15 Gy，用4 mm準直器進行照射[3]。

表1 兩組大鼠不同時間點癇性發作程度的比較(n)

與PTZ致癇組比較：*P<0.05

1.3 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測各組大鼠分別于伽瑪刀照射后12周常規斷頭迅速取腦，在低溫操作臺上分離出額葉及海馬組織。經DMEM培養基漂洗，用0.25%胰蛋白酶37 ℃恒溫消化30 min，再經DMEM培養基漂洗終止消化反應。后用不同口徑的玻璃吸管將腦組織輕柔吹打成單細胞懸液。懸液經濾網過濾后，加入鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(Biotium 公司，美國)(含0.1% F-127)，終濃度為5 μmol/L。再將細胞懸液避光孵育30 min(37 ℃)，用DMEM培養基漂洗2～3次。在載玻片上滴一定量的細胞懸液，待細胞貼壁后，再將其放置于激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)的載物臺上。先在低倍鏡(×10)下找到懸液中的神經細胞，再在高倍鏡(×20)下選取不同視野的神經細胞進行掃描。發射光為530 nm，激發光為488 nm。以熒光強度最強的掃描層面為標準值，每個樣本取20個神經細胞，取其平均值作為每樣本的Ca2+熒光像素值。

2 結果

2.1 癲癇大鼠模型制備情況實驗大鼠于腹腔注射PTZ 3～6次后出現癇性發作，如頭面部抽動、四肢抽動及陣攣、全身肌陣攣發作、跌倒及周身翻滾等。每次于注射后3～5 min出現，隨著注射數次增加，發作程度逐漸加重。每次發作持續40～60 min后逐漸緩解。16只大鼠中共有12只模型制備成功，于注射12～16次后連續出現3次Ⅳ級以上的癇性發作，成功率為75%。

2.2 各組大鼠癲癇發作情況對照組及伽瑪刀對照組大鼠行為正常，無癇性發作。PTZ致癇組大鼠連續注射4周PTZ后每周再次注射時，絕大部分可出現Ⅳ級以上發作。PTZ致癇+伽瑪刀組大鼠經低劑量伽瑪刀照射后，隨時間的延長，每周再次注射PTZ，發作程度逐漸減輕。實驗將Ⅰ～ Ⅲ級發作定為輕度，Ⅳ～Ⅴ級定為重度，于照射后第12周，兩組大鼠發作差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠額葉皮層及海馬神經細胞內Ca2+水平共聚焦顯微鏡檢測結果顯示，與正常對照組相比，伽瑪刀對照組大鼠額葉及海馬神經細胞內的Ca2+熒光強度輕度升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；PTZ致癇組較正常對照組升高；PTZ致癇+伽瑪刀組較PTZ致癇組降低，差異有統計學意義(F皮層=20.936、F海馬=26.189，P<0.001)。見表2和圖1、2。

表2 各組大鼠皮層及海馬神經元內Ca2+熒光像素值的比較

與正常對照組比較：*P<0.05; 與PTZ致癇組比較：ΔP<0.05

圖1 各組大鼠皮層神經元內Ca2+熒光強度

A：正常對照組; B：伽瑪刀對照組; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪刀組

圖2 各組大鼠海馬神經元內Ca2+ 熒光強度

A：正常對照組; B：伽瑪刀對照組; C：PTZ致癇組; D：PTZ致癇+伽瑪刀組

3 討論

Ca2+廣泛分布于機體細胞與體液當中，作為細胞內最重要的第二信使，在信號轉導中發揮著重要作用，參與多種生理功能的調節。正常生理狀態下，神經細胞外的Ca2+濃度約為細胞內的2萬倍，細胞可通過多種調控機制維持細胞內的鈣穩態，如細胞內鈣庫攝取及釋放，Ca2+跨膜轉運等。目前研究[7]表明，Ca2+在各種神經退行性疾病的病生理過程中起著至關重要的作用，細胞內鈣穩態失衡是癲癇發生的觸發因素。關于神經細胞內鈣穩態失衡影響癲癇發病的實驗證據日益增多[8]。癲癇發作時大腦神經細胞內的Ca2+急劇升高超過閾值，神經細胞受到損傷或異常放電，可能是癲癇發生的直接原因。Raze et al[9]研究發現慢性癲癇大鼠海馬神經元內Ca2+濃度升高，并且在致癇后1年神經元內Ca2+濃度仍維持較高水平。 Pal et al[10]將海馬神經元在無Mg2+培養液中培養3 h，發現神經元內的Ca2+水平顯著升高，并出現癇性放電。Ghotbeddin et al[11]應用膜片鉗實驗表明，杏仁核點燃可增強電壓門控Ca2+通道電流，而T型Ca2+通道的選擇性阻斷可抑制杏仁核點燃的進展[12]。以上研究顯示無論離體還是在體的癇性神經元均存在鈣穩態的變化。本研究顯示，致癇大鼠額葉皮層及海馬的神經細胞內Ca2+濃度明顯升高，與近年來的文獻報道一致。

目前大量資料表明，Ca2+作為神經細胞內的重要信使與學習記憶密切相關，Ca2+內流入突觸后膜是觸發形成LTP的必要條件之一。本研究表明PTZ致癇大鼠額葉皮層及海馬神經細胞內Ca2+濃度升高，而癲癇大鼠學習和記憶受損[3]，提示鈣穩態失衡與癲癇大鼠的認知障礙密切相關。課題組前期研究[13]還顯示，PTZ致癇大鼠腦組織N-甲基-D-天氡氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體亞基1、NMDA受體2A及NMDA受體2B過度表達，故推測皮層和海馬組織NMDA受體活性增強，可能是導致癲癇大鼠神經細胞內游離Ca2+水平升高的重要機制。

近年來研究[14]已證實伽瑪刀照射可有效地控制顳葉癲癇的癲癇發作，并對該類患者的認知功能、心理、情緒沒有明顯影響。目前認為低照射劑量(邊緣劑量10～20 Gy)在不損害正常神經元的同時可提高癲癇灶的閾值，產生抗癇作用[15]。但其生物學作用機制仍不明確。本研究結果顯示，邊緣劑量15 Gy的伽瑪刀照射可顯著降低癲癇大鼠皮層和海馬神經細胞內Ca2+水平，而對正常腦組織影響較小，提示低劑量伽瑪刀可能是通過調節神經細胞鈣穩態而起到抗癲癇作用的。然而，伽瑪刀照射對神經細胞內Ca2+的調控機制尚不清楚。目前研究集中在電離輻射對Ca2+異化擴散和細胞膜的Ca2+通道的影響。結合課題組前期的研究結果，低劑量伽瑪刀照射后神經細胞內Ca2+濃度降低可能與癲癇病灶NMDA受體活性減低有關，具體機制有待進一步深入探討。