聚肌胞存在下利培酮與牛血清白蛋白的相互作用及金屬離子的影響

劉 里, 楊曉麗

血清白蛋白(serum albumin ，SA)是血漿中含量最豐富的載體蛋白。當(dāng)藥物通過血漿儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)受體靶點(diǎn)時(shí)，就會(huì)發(fā)生藥理作用。因此，作為藥物載體的SA在藥物對(duì)靶分子發(fā)揮功效過程中起到了十分重要的作用[1]。研究藥物與SA之間的相互作用不僅對(duì)明確藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要意義，還對(duì)藥物的代謝過程，藥代動(dòng)力學(xué)，以及藥物的毒性也意義非凡。然而研究一種藥物與SA相互作用的報(bào)道較多，但兩種藥物與SA的相互作用卻鮮有報(bào)道。實(shí)際上，人們大多數(shù)情況下都是聯(lián)合用藥，所以多種藥物與SA相互作用的相關(guān)研究就尤為重要。利培酮(risperidone，RI)是用于治療急治療精神分裂癥、雙相情感障礙和與自閉癥相關(guān)的易激性有關(guān)的常用藥[2]。一種人工合成的雙鏈核糖核酸-聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid，Poly I:C)是一種干擾素誘導(dǎo)劑，由于其具有抗病毒并調(diào)節(jié)免疫的作用，用于治療慢性乙型肝炎、流行性出血熱流行性乙型腦炎、病毒性角膜炎、帶狀皰疹、各種疣類和呼吸道感染等[3]。牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)與人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)非常相似，具有76%的相同DNA序列，由于其價(jià)格便宜易得，常被用研究藥物做血清白蛋白模型[1]。因此，現(xiàn)以BSA為血清蛋白模型研究Poly I:C對(duì)RI與BSA的相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 熒光光譜測(cè)定

1.1.1猝滅機(jī)制的探討實(shí)驗(yàn) 熒光光譜的測(cè)定使用F-4600型熒光光譜儀(日本日立公司)，并固定10.0 nm狹縫寬度，400 V的光電倍增管負(fù)高壓。在10.0 ml比色管中，依次加入2.0 ml NaCl溶液(0.50 mol/L)，1.0 ml Tris-HCl緩沖溶液(0.10 mol/L，pH=7.40，使用上海虹益儀器儀表有限公司pHS-3C型精密酸度計(jì)調(diào)節(jié)酸度)，1.0 ml BSA溶液(1.0×10-5mol/L，上海阿拉丁生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，0.5 ml Poly I:C(0.089 6 g/L，上海江萊化學(xué)科技有限公司，含量99%)和不同體積的RI溶液(4.146 3×10-7mol/L)用超純水定容。把配置好的溶液分別放到25.9 ℃、35.9 ℃和45.9 ℃溫度下的超級(jí)恒溫水浴(DHG-9035 A型，上海一恒科技有限公司)內(nèi)孵育30 min后，測(cè)定光譜曲線，并得到最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)，并測(cè)定熒光強(qiáng)度值即F0(無RI時(shí)體系的熒光強(qiáng)度)和F(不同濃度RI存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度)。繪制Stern-Volmer關(guān)系曲線[4](其方程表達(dá)式為F0/F=1+KsvCRI=1+Kqτ0CRI，式中τ0是熒光壽命，Kq是速率常數(shù)；Ksv是猝滅常數(shù)；CRI為RI濃度)。

1.1.2金屬離子對(duì)體系影響的實(shí)驗(yàn) 在Poly I:C-RI-BSA體系中分別加入1×10-5mol/L MgSO4、CoCl2、MnCl2、CuSO4和CrCl3之后，然后在上述實(shí)驗(yàn)條件下，把配置好的溶液在25.9 ℃溫度下反應(yīng)30 min后，在λex下掃描光譜曲線并記錄F0(無金屬離子加入時(shí)體系在λem處的熒光值)和F值(金屬離子加入時(shí)體系在λem處的熒光值)。

1.1.3同步熒光光譜的測(cè)定 按照1.1.1方法配置溶液，并在上述實(shí)驗(yàn)條件下，固定Δλ=15 nm和60 nm，掃描熒光光譜曲線。

1.2 紫外-可見光譜研究按照1.2.1方法配置溶液，用Cary 50型紫外-可見光譜儀(美國瓦里安技術(shù)中國有限公司)掃描其隨著RI濃度增加，體系的吸收譜圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Excel 2013 軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，測(cè)定3次取平均值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光發(fā)射光譜固定Poly I:C和BSA濃度不變，改變RI濃度，研究RI的存在對(duì)Poly I:C-BSA熒光發(fā)射光譜的影響，見圖1。在300～450 nm范圍內(nèi)RI和Poly I:C本身無熒光發(fā)射，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無干擾(圖1中的11曲線所示)。Poly I:C-BSA體系的λem在345 nm處(圖1曲線所示)，而RI的加入對(duì)其λem幾乎無影響，只是熒光強(qiáng)度(F值)明顯隨著RI濃度的增加而逐漸減弱。表明在poly I:C存在下RI對(duì)BSA有顯著的抑制作用。

圖1 在不同RI濃度下poly I:C-BSA的熒光發(fā)射光譜

1→10:CBSA =1×10-6mol/L, CRI=(0、0.332、0.415、0.622、1.037、1.202、1.368、1.576、1.783、1.990)×10-7mol/L;11: CRI=3.32×10-8mol/L, CPoly I:C=0.004 48 g/L

2.2 猝滅熒光機(jī)制探究為了探討這兩種藥物對(duì)BSA的機(jī)制，選用最經(jīng)典的Stern-Volmer關(guān)系曲線來研究其熒光猝滅機(jī)制。按照1.2.1方法測(cè)定試液的F0和F，以F0/F為縱坐標(biāo)，CRI為橫坐標(biāo)見圖2。三個(gè)溫度的線性方程列入表1中，對(duì)比由表1中三個(gè)線性方程的斜率即Ksv值可知，溫度越高，直線斜率越大，表明RI和poly I:C對(duì)BSA熒光的猝滅符合動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制。

表1 poly I:C-RI-BSA和的Stern-Volmer方程

采用不受離子強(qiáng)度影響的紫外-可見光譜來研究poly I:C-RI-BSA熒光抑制機(jī)制，其吸收光譜圖(圖3)。對(duì)比圖3中曲線1(poly I:C-BSA體系)和曲線2-10(固定Poly I:C和BSA的濃度，逐漸增大RI的濃度即RI-poly I:C-BSA體系)可知，伴隨著RI濃度的增加，雖然poly I:C-BSA體系的吸收強(qiáng)度增加，但其紫外光譜曲線的峰形與峰位沒有發(fā)生改變。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其完全沒有如靜態(tài)猝滅機(jī)制那樣，由于有新物質(zhì)的生成，而改變紫外譜線。

2.3 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)的測(cè)定應(yīng)用lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[C]方程計(jì)算測(cè)定在poly I:C存在條件下，藥物小分子RI與BSA生物大分子的結(jié)合常數(shù)(Kb)與每一個(gè)BSA與藥物結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)(n)。分別在25.9 ℃、35.9 ℃和45.9 ℃溫度條件下測(cè)定不斷加入RI后，體系的熒光強(qiáng)度，然后以lg[C]為橫坐標(biāo)，lg(F0-F)/F為縱坐標(biāo)做雙對(duì)數(shù)曲線(圖4所示)，得到的雙對(duì)數(shù)方程利于表2中。表2中Kb和n變化較大，表明Kb和n對(duì)溫度很敏感，即蛋白質(zhì)對(duì)藥物的運(yùn)輸受溫度的影響較大。當(dāng)溫度在25.9 ℃時(shí)，Kb和n達(dá)到最大值，n約等于1，可形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；當(dāng)溫度高于298.9K時(shí)，n很小，幾乎不可以形成1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。總之，溫度增加不利于蛋白質(zhì)運(yùn)載藥物。而對(duì)比三個(gè)溫度的Kb值，我們發(fā)現(xiàn)，室溫下(25.9 ℃)的Kb值比分別是35.9 ℃和45.9 ℃溫度下的Kb值的50倍和24倍。這也印證了高于室溫時(shí)，溫度越高對(duì)藥物與蛋白的結(jié)合越不利。

表2 Kb和n的值

圖3 poly I:C-BSA(1)和poly I:C-RI-BSA(2-5)紫外吸收光譜

1→5:CBSA=1×10-6mol/L， Cpoly I:C=0.004 48 g/L，CRI=(0、1.368、1.576、1.783、1.990)×10-7mol/L

圖4 雙對(duì)數(shù)曲線

2.4 相互作用力BSA 與poly I:C和RI兩種藥物相互作用的熱力學(xué)函數(shù)通過van’t Hoff方程求得。其方程表達(dá)式為：

lnKb=(-ΔH/RT)+ΔS/R

(1)

ΔG=-RTlnKb=ΔH-TΔS

(2)

公式中Kb為不同溫度下的結(jié)合常數(shù)， R是摩爾氣體常數(shù)，其數(shù)值為8.314 J/(mol·K)，T為熱力學(xué)溫度，ΔG、ΔH和ΔS分別代表吉布斯自由能變、焓變和熵變。根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算ΔG、ΔH和ΔS結(jié)果列于表3中。ΔG<0表明聚肌胞和利培酮與BSA結(jié)合是自發(fā)反應(yīng)，ΔH<0表明該結(jié)合反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)。

表3 熱力學(xué)函數(shù)

2.5 結(jié)合部位的確定BSA分子由3個(gè)同源結(jié)構(gòu)域組成即域(Ⅰ～Ⅲ)，每個(gè)域相應(yīng)地產(chǎn)生兩個(gè)子域(IA、IB等)。BSA中有兩個(gè)特異性與配體結(jié)合的位點(diǎn)，即結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ(在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA)以及Ⅱ(在亞結(jié)構(gòu)域ⅢA中)。藥物分子作為配體與BSA結(jié)合的部位可以從相互過程中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況推斷出。首先分別在λex=280 nm/295 nm 激發(fā)時(shí)掃描體系的發(fā)射光譜，然后由λem處的熒光值繪制熒光猝滅曲線(圖5所示)。

2.6 藥物協(xié)同性通過Hill曲線(其曲線方程為lgH/(1-H)=lgK+nHlg[C]，式中H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，K為結(jié)合常數(shù)，nH為Hill系數(shù)，[C]為藥物的濃度)來推斷聚肌胞和利培酮的藥物協(xié)同性。首先利用F和F0的值計(jì)算出B=(F0-F)/F0，以1/[C]為橫坐標(biāo)，1/B為縱坐標(biāo)做線性圖，1/Bm為直線的截距，從而能算成Bm值。然后在計(jì)算出H/(1-H)值，其值等于B/(Bm-B)，最后求出Hill方程，結(jié)果見表4。由表4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溫度改變時(shí)，nH值變動(dòng)不大，表明溫度對(duì)藥物協(xié)同性的影響不明顯。溫度的提升會(huì)增加nH值，這與上述描述的動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制相吻合。

圖5 F/F0與CRI/CBSA關(guān)系曲線

表4 不同溫度下的nH值

2.7 聚肌胞和利培酮對(duì)血清白蛋白構(gòu)象的影響當(dāng)波長(zhǎng)間隔(Δλ)固定在15 nm或60 nm處時(shí)，同步熒光能分別給出酪氨酸殘基(Tyr)和色氨酸殘基(Trp)的特征信息。聚肌胞和利培酮對(duì)BSA的同步熒光光譜的影響如由圖6所示。當(dāng)增大藥物濃度時(shí)，F(xiàn)值逐漸降低，酪氨酸殘基的λem向短波移動(dòng)約2 nm，色氨酸殘基的λem向長(zhǎng)波移動(dòng)約4 nm，表明聚肌胞和利培酮藥物的加入幾乎不改變了Tyr和Trp所處的微環(huán)境。

2.8 金屬離子的影響常見離子廣泛分布于人體或動(dòng)物血液中。因此，應(yīng)該考慮有很多血液系統(tǒng)和生物體中的對(duì)結(jié)合蛋白質(zhì)有特定能力的微量金屬離子。因此，一些常見金屬離子(如Mg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+和Cr3+)作為研究對(duì)象，來探究其對(duì)藥物與BSA結(jié)合的影響(表5)。由表5可知，金屬離子不同，Kb′和n差別較大，由于原子結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，才會(huì)使結(jié)合參數(shù)值改變很大。Cu2+、Cr3+和Mn2+的存在，增大了Kb和n值，這表明金屬離子促進(jìn)了藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用。其中Cr3+的存在最大程度地影響藥物與蛋白的相互作用。然而Co2+和Mg2+的存在減小了原本的Kb和n值，說明Co2+和Mg2+對(duì)聚肌胞和利培酮與BSA結(jié)合產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)作用。它們能阻礙了藥物與BSA的結(jié)合作用，縮短了聚肌胞和利培酮在血液中的停留時(shí)間，從而使藥效得到增強(qiáng)。

圖6 同步熒光光譜圖

1→10:CBSA=1×10-6mol/L, CPoly I:C=0.004 48 g/L,CRI=(0、0.332、0.415、0.622、1.037、1.202、1.368、1.576、1.783、1.990)×10-7mol/L

3 討論

本研究小組已經(jīng)報(bào)道RI和poly I:C都能猝滅BSA發(fā)生的熒光[2-3]，而上述結(jié)果進(jìn)一步表明RI和poly I:C能同時(shí)猝滅BSA的熒光，RI能抑制poly I:C-BSA體系的熒光強(qiáng)度，為探討poly I:C存在下RI對(duì)BSA抑制機(jī)制提供了研究前提條件。表1中三個(gè)Kq都大于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)值[4]，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎有悖于動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制的結(jié)合。有文獻(xiàn)[4]報(bào)道離子強(qiáng)度會(huì)增大Kq值，為了模擬人體的生理?xiàng)l件，我們體系的NaCl濃度較高(0.1 mol/L)，故導(dǎo)致其Kq值超過了其極值。這就需通過其它方法進(jìn)一步確定其猝滅機(jī)制。紫外光譜這充分印證了藥物只改變BSA的激發(fā)態(tài)，不影響紫外吸收光譜發(fā)生動(dòng)態(tài)猝滅的結(jié)果[4]。綜上所述，poly I:C-RI-BSA體系的作用機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅，與無poly I:C存在條件下，RI對(duì)BSA的猝滅機(jī)制[2]相同。

表5 金屬離子對(duì)藥物與BSA結(jié)合常數(shù)的影響

Kb和Kb′分別表示在金屬離子不存在和存在時(shí)聚肌胞和利培酮與BSA的結(jié)合常數(shù)；“*”代表無任何金屬離子情況

為了對(duì)比單一藥物與兩種藥物同時(shí)與蛋白結(jié)合的作用，我們同時(shí)對(duì)比了相應(yīng)的n和Kb值。當(dāng)只有一種藥物RI與BSA相作用時(shí)，n隨著溫度的升高而增大，跟室溫下poly I:C和RI同時(shí)與BSA相互作用時(shí)的n值相差不大。但高于室溫后，兩種藥物與BSA結(jié)合的n值就明顯較小，反而不能形成結(jié)合位點(diǎn)。這表明poly I:C加入使RI-BSA體系結(jié)合位點(diǎn)減少，不利于藥物在血液中的運(yùn)輸。對(duì)比表3中Kb(RI-BSA)[2]和Kb(poly I:C-RI-BSA)值，我們發(fā)現(xiàn)在室溫時(shí)Kb(RI-BSA) 值為Kb(poly I:C-RI-BSA) 的2.8倍；當(dāng)溫度升高10 ℃后，Kb(RI-BSA)值是Kb(poly I:C-RI-BSA) 的2 800倍；當(dāng)溫度升高20 ℃時(shí)Kb(RI-BSA) 值是Kb(poly I:C-RI-BSA)的2 100倍。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明聚肌胞的加入使體系的穩(wěn)定性減弱，推測(cè)由于Poly I:C與RI發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致Kb減小，從而縮短了藥物停留時(shí)間，增大血液中的藥物濃度，對(duì)藥效產(chǎn)生有益影響。

根據(jù)ΔH和ΔS值的正負(fù)情況，利用Ross et al[5]總結(jié)出的藥物與大分子相互作用的模型可以推斷出其分子間作用力類型。ΔH<0且ΔS<0表明在聚肌胞存在下，利培酮與BSA直接的作用力以氫鍵和范德華力為主。這與只有利培酮存在時(shí)，與BSA的作用力(疏水作用力)[2]類型不同，推測(cè)其原因?yàn)樵诰奂“c利培酮同時(shí)存在時(shí)，改變其與BSA的分子間的力的類型。由圖 5可知，兩種激發(fā)波長(zhǎng)下，Poly I:C -RI-BSA體系的猝滅曲線是獨(dú)立的兩條曲線沒有相交和重疊的區(qū)域，而且F/F0值在λex=280nm時(shí)比λex=295nm激發(fā)時(shí)的高，這表明在色氨酸和酪氨酸殘基都參與利培酮和聚肌胞與BSA的相互作用[6-8]，ⅡA是結(jié)合部位，這與只有利培酮存在下和BSA結(jié)合的部位相同[2]。三個(gè)溫度下的nH均接近1，說明聚肌胞和利培酮與BSA結(jié)合過程中，聚肌胞和利培酮與BSA分子之間幾乎沒有協(xié)同作用。由表4可知：nH(RI-BSA)[2]

聚肌胞和利培酮使BSA伸展，減少了氨基酸殘基間的能量傳遞，從而猝滅BSA熒光[9]，色氨酸的猝滅程度大于酪氨酸，表明聚肌胞和利培酮與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更加接近于色氨酸殘基，這與利培酮對(duì)BSA構(gòu)象影響相同。Cu2+、Co2+、Mg2+和Mn2+存在時(shí)，Kb′(poly I:C-RI-BSA)

綜上所述，聚肌胞和利培酮同時(shí)存在時(shí)與BSA之間的猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅機(jī)制。氫鍵和范德華力起了主要作用，聚肌胞和利培酮分子之間幾乎沒有協(xié)同性，三元體系結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅡA中。poly I:C-RI對(duì)BSA的構(gòu)象產(chǎn)生很小的影響。此外，在常見金屬的存在時(shí)會(huì)影響聚肌胞和利培酮與BSA的結(jié)合。Poly I:C的加入對(duì)RI藥效的增強(qiáng)起到了有益作用。這些研究對(duì)今后聯(lián)合用藥的臨床指導(dǎo)提供重要參考價(jià)值。