TGFβ1-Sp1信號通路靶向調控豚鼠鞏膜成纖維細胞分泌與合成膠原表達的研究

應充慧， 朱子誠，孫思勤，張 楚

轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)參與近視鞏膜重塑[1]，轉錄因子特異性蛋白1(specificity protein 1，Sp1)被認為是TGF-β1下游能標靶調節(jié)I型膠原的合成和降解的蛋白[2-3]，但Sp1是否在鞏膜成纖維細胞中表達、是否參與了Ⅰ型膠原的合成與降解、在近視鞏膜重塑中的具體功能為何均未見報道。該研究擬通過豚鼠鞏膜成纖維細胞，利用免疫組化、qRT-PCR等分子生物學技術研究成纖維細胞內TGF-β1-Sp1對I型膠原蛋白表達的影響、探明TGF-β1-Sp1信號通路在鞏膜重塑過程中的功能，進而為靶向TGF-β1-Sp1信號通路調控鞏膜成纖維細胞生成與合成膠原蛋白提供實驗數據，為開發(fā)近視治療手段提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 隨機選用出生7 d左右、100～140 g的健康新生三色豚鼠10只，由中國科技大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供，雌雄不限。

1.1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國GIBCO公司)；TGFβ1(美國Sigma公司)；TGFβ1抑制劑(SB-431542)、Sp1抑制(Plimcamycin)(美國MCE公司)；Sp1抗體(1 ∶150)(21962-1-AP)、Ⅰ型膠原抗體(1 ∶150)(14695-1-AP)(武漢三鷹生物技術有限公司)；免疫組化二抗通用型PV6000(北京中杉金橋公司)。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)豚鼠鞏膜成纖維細胞 首先在無菌條件和操作下取出豚鼠眼球，用PBS液漂洗眼，沿角膜緣的切口切除角膜并去除晶狀體、玻璃體、視網膜、色素上皮-脈絡膜組織。分離后的鞏膜組織,將其裁剪成1 mm2的組織塊，PBS液再洗3次，接種于25 cm培養(yǎng)瓶壁上, 組織塊間距0.3～0.5 cm，置于37 ℃、50 ml/L CO2的培養(yǎng)箱中使組織塊貼壁。靜置2 h后，加入含體積分數15%胎牛血清及雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)液。使培養(yǎng)液與組織塊接觸。每3～5 d換液1次。當細胞密度達到80%時進行傳代，用濃度為0.25%胰蛋白酶消化，加入2 ml新的完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕將細胞吹打混勻后，分裝成2或3瓶作傳代培養(yǎng)。取3代細胞分成4組，第1組加入最終濃度10 ng/ml的TGFβ1，第2組加入濃度10 ng/ml的TGFβ1+100 ng/ml的TGFβ1抑制劑，第3組加入濃度10 ng/ml的TGFβ1+100 ng/ml的Sp1蛋白抑制劑，第4組為空白對照組。

1.2.2免疫組織化學染色細胞鑒定及檢測豚鼠鞏膜中Sp1和Ⅰ型膠原蛋白的表達 分別從4組中取細胞制細胞爬片，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，PBS重復浸洗2 min共3次，冰丙酮固定10 min。PBS浸洗 min，反復3次，含3% H2O2的甲醛室溫下用 30 min，以封閉內源性酶，0.1%胰蛋白酶室溫下消化5 min，滴加相應一抗(滴度為1 ∶50)濕盒內4 ℃過夜，復溫后，滴加相應二抗孵育30 min，以上每次加均用PBS浸洗2 min，反復3次，然后用DAB顯色,蘇木精復染。觀察Sp1蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、波形蛋白的表達。

1.2.3qRT-PCR檢測細胞內TGFβ1-Sp1對Ⅰ型膠原的表達 分別將4組處理后的的細胞根據說明提取總RNA，測定濃度和純度后，按試劑盒說明進行逆轉入，得到逆轉錄cDNA，存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA作為模板進行PCR擴增。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃延伸10 min后保存。PCR產物進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并進行拍照，為了確保準確性，所有實驗進行了至少3次。實驗中引物核苷酸序列Sp1：上游引物5’-CTCAAAGGAACAGAGTGGCA-3’，下游引物5’-GAGCTGGGAGTCAAGGTAGC-3’；Ⅰ型膠原:上游引物:5’-ACAAGCGATTACACACCCAA-3’,下游引物:5’-TTAGTTTCCTGCCTCTGCCT-3’。

1.2.4各組中豚鼠鞏膜成纖維細胞中的Sp1和Ⅰ型膠原的蛋白表達檢測 4組中分別加入細胞裂解液裂解，提取每組中的總蛋白，BCA法測量鞏膜組織蛋白濃度，采用Western blot法測定鞏膜組織中Sp1和Ⅰ型膠原蛋白表達水平，以Sp1抗體為一抗、Ⅰ型膠原抗體為一抗，β-actin為內參。采用 Quantity One軟件進行條帶灰度分析，Sp1蛋白相對表達水平=Sp1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，Ⅰ型膠原蛋白相對表達水平=Ⅰ型膠原蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.2.5判斷標準 免疫組化染色爬片采用雙盲法閱片。Sp1蛋白及Ⅰ型膠原免疫組化染色陽性產物為棕黃色細顆粒狀。采用半定量標準，每例隨機觀察 10個高倍視野，通過計算陽性細胞數及記錄細胞的染色深淺對其進行評價:陽性細胞數≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50% 為 2 分，51% ～75% 為 3 分，≥76%為4分; 按陽性細胞的著色強度計分:無陽性著色或與背景均勻一致的淡黃色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將兩項積分相乘:0 分為(-) ，1～4 分為(+) ，5～8 分為中度陽性() ，9～12 分為() 。結果重復觀察2次，計分不一致者需再次觀察確認。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察組織塊培養(yǎng) 4～5 d后可發(fā)現(xiàn)有細胞從組織塊中爬出并開始貼壁, 細胞透明，形態(tài)為梭形, 胞體飽滿、扁平而長突起 (圖1)。細胞傳3代后，可見細胞透明呈梭形,大小較一致，排列成不規(guī)則的柵欄狀(圖2)。

2.2 細胞鑒定成纖維細胞胞質可見大量波形蛋白表達,本試驗鑒定結果為波形蛋白表達陽性，細胞漿中可見棕黃色染色(圖3)。

2.3 鞏膜成纖維細胞中Sp1蛋白和Ⅰ型膠原的表達各組細胞中均可見Sp1和Ⅰ型膠原蛋白的表達，可見棕黃色染色(圖4)。TGFβ1組中細胞核內Sp1蛋白顯色強于對照組(t=3.337，P<0.05)；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組中弱于對照組(t=4.163，P<0.05)；TGFβ1+Sp1抑制劑組中比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組強但比對照組弱(t=13.86，P<0.05)。TGFβ1組中細胞核內Ⅰ型膠原顯色強于對照組(t=3.464，P<0.05)；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組中弱于對照組(t=4.434，P<0.05)；TGFβ1+Sp1抑制劑組中比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組強但比對照組弱(t=12.12，P<0.05)。見圖5。

圖1 原代培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞 ×200 圖2 傳3代的豚鼠鞏膜成纖維細胞 ×200圖3 免疫熒光化學檢測波形蛋白陽性 ×200

圖4 免疫組織化學染色檢測各組Ⅰ型膠原和Sp1蛋白的表達 ×200

A：TGFβ1+TGFβ1組中的Ⅰ型膠原；B：TGFβ1+Sp1抑制劑組中的Ⅰ型膠原；C:空白對照組中的Ⅰ型膠原；D：TGFβ1中的Ⅰ型膠原；E：TGFβ1+TGFβ1組中的Sp1蛋白；F：TGFβ1+Sp1組中的Sp1蛋白；G：空白對照組中的Sp1蛋白；H：TGFβ1組中的Sp1蛋白

圖5 各組中Sp1蛋白和Ⅰ型膠原的定量及相關性

A：空白對照組；B：TGFβ1組；C：TGFβ1+Sp1抑制劑組；D：TGFβ1+TGFβ1抑制劑組；與空白對照組比較：*P<0.05；與TGFβ1+TGFβ1抑制劑組比較：#P<0.05

2.4 豚鼠鞏膜成纖維細胞中Sp1蛋白和Ⅰ型膠原的mRNA表達豚鼠鞏膜成纖維細胞中均有Sp1和Ⅰ型膠原的mRNA表達陽性(圖6、7)。TGFβ1組中Sp1蛋白mRNA表達量強于對照組(t=3.074，P<0.05)；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組中弱于對照組(t=4.330，P<0.05)；TGFβ1+Sp1抑制劑組中比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組強但比對照組弱(t=6.736，P<0.05)。TGFβ1組細胞中Ⅰ型膠原mRNA表達量強于對照組(t=2.882，P<0.05)；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組中弱于對照組(t=3.695，P<0.05)；TGFβ1+Sp1抑制劑組中比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組強但比對照組弱(t=5.092，P<0.05)。見圖8。

圖6 qRT-PCR檢測各組豚鼠鞏膜成纖維細胞中Sp1 mRNA的表達

M：標準蛋白分子量；1：空白對照組；2：TGFβ1+Sp1抑制劑組3：TGFβ1組；4：TGFβ1+TGFβ1抑制劑組

圖7 qRT-PCR檢測各組豚鼠鞏膜成纖維細胞中Ⅰ型膠原的 mRNA的表達

M：標準蛋白分子量；1：空白對照組；2：TGFβ1+Sp1抑制劑組；3:TGFβ1組；4：TGFβ1+TGFβ1抑制劑組

2.5 豚鼠鞏膜成纖維細胞中Sp1和Ⅰ型膠原的蛋白表達豚鼠鞏膜成纖維細胞中均有Sp1和Ⅰ型膠原的蛋白表達陽性(圖9)。TGFβ1組中Sp1和Ⅰ型膠原的蛋白表達量強于對照組(P<0.05)；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組中弱于對照組(P<0.05)；TGFβ1+Sp1抑制劑組中比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組強但比對照組弱(P<0.05)。

圖8 各組中Sp1蛋白和Ⅰ型膠原的mRNA熒光定量及相關性

A：空白對照組；B：TGFβ1+Sp1抑制劑組；C:TGFβ1組；D：TGFβ1+TGFβ1抑制劑組；與空白對照組比較：*P<0.05;與TGFβ1+TGFβ1抑制劑組比較：#P<0.05

3 討論

近視的發(fā)病機制尚未完全明了，多數學者認為近視是遺傳因素和外部環(huán)境共同導致的；在生理改變上，近視的眼軸延長，與鞏膜重塑密切相關，大量的基礎研究實驗和臨床研究均表明鞏膜生物力學性質的改變和細胞外基質的重塑、細胞類型的轉變是導致眼球眼軸延長的主要原因[3]。鞏膜中含量最多的是膠原纖維，占鞏膜凈重的90%，其中Ⅰ型膠原纖維在鞏膜中占75%以上，在近視鞏膜重塑中Ⅰ型膠原的表達量明顯下降[4-5]。TGF-β1是一種多肽生長因子，存在于多種細胞和組織中，具有廣泛的生物學活性，調控細胞增殖、分化、免疫監(jiān)視等[6]。已有研究[7-8]認為TGFβ1是鞏膜重塑中重要的轉錄因子，在鞏膜組織中的表達可以促進Ⅰ型膠原的表達。本研究結果顯示，在免疫組織化學染色法和逆轉錄PCR檢測法中，TGFβ1組中的Ⅰ型膠原蛋白及其mRNA量較空白對照組表達增強，TGFβ1+TGFβ1組中較空白對照組減弱，從而可以推測在豚鼠鞏膜成纖維細胞中TGFβ1與Ⅰ型膠原存在正相關性。

圖9 Western blot法檢測各組豚鼠鞏膜成纖維細胞中Sp1和Ⅰ型膠原的蛋白表達

A：Sp1蛋白表達；B：Ⅰ型膠原的蛋白表達；a：空白對照組；b：TGFβ1組；c：TGFβ1+Sp1抑制劑組；d：TGFβ1+TGFβ1抑制劑組；與空白對照組比較：*P<0.05

轉錄因子Sp1在所有哺乳動物的細胞中有所表達，且Sp1調節(jié)多種細胞進程，包括細胞周期進程，增殖，生長，代謝和凋亡[9-10]。Martin-Gallausiaux et al[11]的研究中表明TGF-β1可與Sp1結合，并可激活轉錄因子Sp1。在Li et al[12]的研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β1-Sp1信號通路在調節(jié)纖維化中起作用。已有研究[13-14]表明一定濃度的TGFβ1可以刺激轉錄因子Sp1的活化，并促進Ⅰ型膠原的表達。本項研究中顯示，在免疫組織化學染色法和逆轉錄PCR檢測法中，TGFβ1的細胞組中的Sp1和Ⅰ型膠原蛋白表達及mRNA量較空白對照組均增強；TGFβ1+TGFβ1抑制劑組較空白對照組均減弱；TGFβ1+Sp1抑制劑組中較空白對照組均減弱，但比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組均增強。進而表明豚鼠鞏膜成纖維細胞中TGFβ1與Sp1存在正相關性。Sp1的表達及mRNA的量與1型膠原的表達及mRNA的量成高度正相關，這說明Sp1與1型膠原在豚鼠鞏膜成纖維細胞中的變化趨于一致，進而推測TGFβ1可能通過Sp1來調控Ⅰ型膠原的合成和降解。

在本研究中，TGFβ1+Sp1抑制劑組中Sp1和Ⅰ型膠原蛋白的表達及mRNA量較空白對照組均減弱，但比TGFβ1+TGFβ1抑制劑組的均增強。這一現(xiàn)象可能是TGFβ1存在其他信號通路調控Ⅰ型膠原合成所造成的，具體還存在何種信號通路目前尚不清楚，需要進一步的研究。